運動疲勞大鼠心肌細胞L型鈣通道生物物理特性的研究

1、運動疲勞大鼠心肌細胞L型鈣通道生物物理特性的研究    2012-03-09     論文導讀:研究運動疲勞對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流及生物物理學特性的影響,證明L-型鈣通道直接參與到運動疲勞導致的細胞內(nèi)鈣濃度變化中。方法:48只大鼠雌雄不拘,隨機分成對照組和運動疲勞組。采用連續(xù)15天游泳耐力訓練方法建立運動疲勞大鼠模型;應用膜片鉗技術檢測.    研究運動疲勞對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流及生物物理學特性的影響,證明L-型鈣通道直接參與到運動疲勞導致的細胞內(nèi)鈣濃度變化中

2、。方法:48只大鼠雌雄不拘,隨機分成對照組和運動疲勞組。采用連續(xù)15天游泳耐力訓練方法建立運動疲勞大鼠模型;應用膜片鉗技術檢測運動疲勞對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流的影響。結果:運動疲勞大鼠全細胞L-型鈣電流峰值(IpeakCaL)顯著增加:全細胞IpeakCaL電流從-470±11.73 pA變化到- 819.90±10.78 pA, n= 8,P< 0.05,運動性疲勞組較對照組增幅74.60%;2)膜片鉗技術檢測L-型鈣電流的激活和失活通道動力學特性:運動疲勞模型組大鼠心肌細胞的L-型鈣電流的失活曲線右移,而激活曲線與對照組相比沒有變化。結論:運動疲勞引起大鼠L

3、-型鈣通道特性改變,使得鈣電流增強,導致心肌細胞內(nèi)鈣平衡調(diào)節(jié)紊亂。運動性疲勞指機體在生理過程中不能繼續(xù)在特定水平上進行或整個機體不能維持預定的運動強度。運動性疲勞產(chǎn)生機制方面的研究,是當前體育科學中面對的重要課題,雖對此進行了廣泛而深入的研究,但導致運動疲勞的生理機制是一個極其復雜的問題,對于運動疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關機制的研究仍存在許多爭議,并且存在許多假說,如中樞神經(jīng)疲勞學說、能量衰竭學說、神經(jīng)-肌肉疲勞學說、代謝產(chǎn)物堆積學說、氧自由基-脂質(zhì)過氧化學說、鈣離子代謝紊亂學說、體溫調(diào)節(jié)失衡學說等等,其中,離子代謝紊亂機制在運動性疲勞中的研究越來越受到人們的重視,而鈣離子平衡紊亂的研究最為

4、重要。此48外,運動性疲勞對心臟功能的影響雖有所研究,但其影響作用及機制仍然不清楚,尤其是在分子、細胞水平上對心肌細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)變化的研究沒有報道。因此,本研究擬通過膜片鉗技術探索運動疲勞對心肌細胞L-型鈣通道電流及生物物理學特性激活失活曲線的影響,探索運動疲勞與鈣通道的關系,證明L-型鈣通道直接參與到運動疲勞導致的細胞內(nèi)鈣濃度變化中,導致心肌細胞發(fā)生鈣超載,造成心肌損傷。材料與方法：驗動物Wistar大鼠48只(購自吉林大學基礎醫(yī)學院實驗動物中心),體重220 g±25 g,雌雄不拘,隨機分為運動疲勞組和對照組,每組24只,自由攝食,飼養(yǎng)環(huán)境溫度19±4,相對濕度(50

5、±10)%。儀器設備與試劑儀器設備: L-型鈣通道離子電流測定使用膜片鉗系統(tǒng)(德國進口HEKA公司EPC-10)。試劑:膠原酶型,美國Sigma公司;牛血清白蛋白,博越生物公司;尼莫地平,美國Sigma公司。標準溶液:KraftBruhe液;L-型鈣通道電極內(nèi)液;L-型鈣通道細胞外液。實驗方法：運動疲勞模型的制備對大鼠進行15天游泳力竭訓練,實驗水深40 cm±5cm,水溫30±2,前10天每天1次,每次3 h訓練,后5天每天2次,每次3 h訓練。力竭階段標準為大鼠沉入水底并且3 s內(nèi)無力返回水面,此時及時撈起,休息2 min后繼續(xù)游泳,并完成規(guī)定的訓練時間。運動

6、疲勞模型制備如下:每12只大鼠為1組,編號,第1天開始將編號為1的大鼠放入水池中進行游泳訓練,第2天放入1號及2號大鼠,第3天放入1、2、3號大鼠,依次類推,到第12天加入編號為12的大鼠,共同游泳訓練至規(guī)定天數(shù),該組大鼠疲勞模型建立完畢后,進行下一組疲勞模型建立實驗。取樣相應編號的大鼠在其第15天的游泳訓練近結束時,當大鼠出現(xiàn)沉入水底無力返回水面即力竭狀態(tài)下,立即取出該運動疲勞大鼠模型,不予任何休息恢復,即刻頸部脫臼處死,迅速開胸取心,采用Langendorff離體灌流分離心肌細胞。大鼠心室肌細胞分離采用Langendorff法離體灌流心臟,大鼠頸部脫臼處死,迅速開胸取出心臟,置于4含Ca2

7、+臺氏液清洗修剪,經(jīng)主動脈將心臟懸掛于Langendorff離體灌流裝置上,由主動脈進行逆向灌流,灌流液保持37、通入95%O2+5%CO2混合氣體。首先用含鈣臺式液灌流心臟復跳,泵出心腔內(nèi)殘留血液,更換為無鈣臺氏液灌流至心臟停止跳動,用含0.16 mg/ml型膠原酶和0.16 mg/ml牛血清白蛋白的無鈣臺氏液60 ml反復灌流心臟至心肌消化完全。消化結束后,剪下心室,在KB液(g/L:KOH 3.928,L-谷氨酸7.357,KCl 2.982,?；撬?.503,KH2PO42.722,MgCl2·6H2O 0. 601,葡萄糖1. 981, HEPES 2. 383,EGTA

8、0.19,KOH調(diào)pH值至7.4)中剪塊、吹打,鏡檢含80%以上單個桿狀細胞后,置于KB液中4保存。運動疲勞是運動訓練過程的一個重要的問題,但對于運動疲勞產(chǎn)生的原因以及其中的相關機制的研究仍存在許多爭議。運動疲勞對心血管系統(tǒng)的影響方面,現(xiàn)認為在運動過程中,心臟提供的血流量已滿足不了工作肌肉對氧和營養(yǎng)物質(zhì)及運走過多代謝產(chǎn)物的需求6,其中由于運動性疲勞而導致的心肌細胞鈣離子平衡的紊亂是對心肌損傷中甚為重要的環(huán)節(jié)。Ca2+在維持身體結構和細胞功能方面發(fā)揮著重要作用,幾乎體內(nèi)各種細胞功能均與鈣離子調(diào)節(jié)有關。Ca2+活潑的特性使其容易結合細胞內(nèi)的各種緩沖位點,這些位點通過結合肌鈣蛋白、收鈣素、鈣調(diào)蛋白和

9、ATP等物質(zhì)11,進而發(fā)揮重要的生理功能,所以,細胞內(nèi)鈣離子是調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導和其他細胞生理過程重要的第二信使。而在心肌細胞中,游離鈣作為偶聯(lián)因子誘發(fā)心肌細胞興奮與收縮偶聯(lián),進而產(chǎn)生心肌收縮,同時,胞內(nèi)鈣對增強心肌收縮力及收縮速率方面有著重要的作用,因此,不管心肌外部50體育科學2011年(第31卷)第11期的調(diào)節(jié)機制多復雜,最后都可以歸結為細胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)5。近年來,運動性疲勞中Ca2+在心臟的代謝已受到重視。以往的研究認為,Ca2+在運動性疲勞中起著至關重要的作用,尤其是其對線粒體膜結構以及功能的影響方面。運動性狀態(tài)下心肌線粒體的結構和功能發(fā)生了明顯變化,這些變化可能是引起疲勞狀態(tài)下心肌

10、損傷的主要原因,而線粒體的這種損傷也與細胞內(nèi)鈣離子有直接關系。細胞以及線粒體內(nèi)的鈣聚集嚴重影響細胞正常功能,導致細胞產(chǎn)生程序性死亡(凋亡),細胞內(nèi)鈣超載常作為細胞結構損傷的特征,線粒體內(nèi)的鈣代謝紊亂超載將造成細胞不可逆損害。所以,Ca2+在運動性疲勞中起著重要的作用,有可能是其產(chǎn)生的一個中樞機制,即胞漿內(nèi)鈣超載、線粒體里鈣聚集是造成力竭損傷的主因。而關于心肌細胞胞漿內(nèi)鈣超載機制研究甚少。心肌細胞胞漿內(nèi)鈣濃度的增加主要是通過肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子釋放或由細胞膜上的鈣離子通道進入的兩種方式實現(xiàn)的。因此,在本研究中,我們通過膜片鉗技術檢測了正常大鼠和運動疲勞大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道電流的變化,以及運動疲

11、勞后大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道生物學特性的改變,通過對于運動疲勞后鈣通道的研究,揭示導致細胞內(nèi)Ca2+增多、造成細胞內(nèi)鈣超載、最終使心肌細胞內(nèi)Ca2+平衡調(diào)節(jié)紊亂的原因。我們的研究發(fā)現(xiàn):1)運動性疲勞大鼠心肌細胞L-型鈣通道ICaL峰電流的顯著增強:全細胞ICaL峰電流從-470±11.73 pA/pF變化到-819.90±10.78 pA/pF,比對照組增加了74.60%,表明與正常細胞相比,運動疲勞后的心肌細胞單位時間內(nèi)通過細胞膜L-型鈣通道進入細胞內(nèi)的Ca2+數(shù)量顯著增加,造成細胞內(nèi)鈣超載;2)通過對運動疲勞大鼠的L-型鈣通道的動力學研究發(fā)現(xiàn),該組大鼠L型-鈣通道失活

12、曲線發(fā)生了右移,激活曲線無變化,表明運動疲勞模型組的大鼠L-型鈣通道失活過程更難,運動疲勞抑制了鈣通道的失活過程,造成鈣通道關閉延遲,單位時間內(nèi)經(jīng)由通道進入細胞的鈣離子數(shù)量增加,這種鈣通道生物物理學特性的改變導致細胞內(nèi)鈣調(diào)節(jié)的紊亂。本研究首次直接觀察到了由于力竭運動而導致大鼠心肌細胞膜L-型鈣通道電流增強作用,證實了運動性疲勞產(chǎn)生的細胞內(nèi)鈣超載部分直接因素是通過改變細胞膜L-型鈣通道生物物理學特性而實現(xiàn)的,揭示了運動疲勞狀態(tài)下細胞內(nèi)鈣離子濃度升高的分子、細胞生理學機制,對于解釋力竭造成的心肌細胞損傷有重要意義,為在體育運動訓練中,選擇合適的訓練強度提高運動成績,提供理論依據(jù)。結論作者研究了力竭

13、運動對大鼠心肌細胞L-型鈣通道電流的變化及鈣通道生物物理學特性的改變,發(fā)現(xiàn)2周的力竭運動可導致心肌L-型鈣通道電流振幅增強,激活曲線無變化,失活曲線顯著右移,證明了L-型鈣通道電流及生物物理學特性改變是運動疲勞導致細胞內(nèi)鈣超載的直接原因之一的分子、細胞生理學機制,由此產(chǎn)生細胞內(nèi)鈣超載、鈣平衡調(diào)節(jié)紊亂。在介紹持續(xù)農(nóng)業(yè)模式、物理農(nóng)業(yè)、農(nóng)業(yè)物理學和生物物理學基本概念和相互關系的基礎上,結合我國農(nóng)業(yè)生物物理學的發(fā)展現(xiàn)狀,提出在高等農(nóng)業(yè)院校建設生物物理研究所的創(chuàng)新人才培養(yǎng)目標;根據(jù)高等農(nóng)業(yè)院校的專業(yè)實際,突出生物學專業(yè)和物理學的關系,并由此引出生物物理研究機構在生物類專業(yè)本科生和研究生創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力

14、培養(yǎng)中的作用;結合國家農(nóng)業(yè)發(fā)展規(guī)劃和農(nóng)業(yè)生物物理發(fā)展趨勢,對農(nóng)業(yè)生物物理研究所和農(nóng)業(yè)生物物理學科的發(fā)展對持續(xù)農(nóng)業(yè)模式發(fā)展的影響進行了展望。以化學肥料和化學農(nóng)藥為代表的"化學農(nóng)業(yè)"雖極大地提高了農(nóng)作物產(chǎn)量,但卻不可避免地導致了土質(zhì)退化、環(huán)境惡化、生態(tài)破壞、食品安全等問題。為確保人類社會的可持續(xù)發(fā)展,有識之士逐漸提出可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)模式:"物理農(nóng)業(yè)"和"生物朱杰,等:生物物理研究機構在生物類專業(yè)創(chuàng)新人才培養(yǎng)中的作用工程"。目前,我國的物理農(nóng)業(yè)和農(nóng)業(yè)物理技術發(fā)展卻很緩慢,水平也較低,這與我國農(nóng)業(yè)生物物理的發(fā)展水平較低密切相關。生物物理學是應用

15、物理學的概念、理論和方法研究生物大分子、細胞(器)、組織甚至器官結構與功能的關系、生命過程中的物理學規(guī)律以及物理因素對生物系統(tǒng)作用機制的科學,是物理學和生物學相結合產(chǎn)生的一門交叉學科,它的發(fā)展對生物學從定性的觀察描述逐步走向精確(定量)科學的發(fā)展起著關鍵作用。而當前制約我國農(nóng)業(yè)生物物理快速、深入發(fā)展的主要因素是科學研究的三個分散性:研究隊伍分散性,研究內(nèi)容分散性,成果交流分散性。而建立專門的生物物理研究機構,則可集中優(yōu)秀科技人才和優(yōu)勢實驗設備,在宏觀統(tǒng)籌下集中力量對一些關鍵和重大問題進行攻關,也有利于研究成果的交流。在高等農(nóng)業(yè)院校建立生物物理研究機構還同時承擔著生物類專業(yè)本科生實驗教學、研究生

16、工程訓練及課題研究的作用,在培養(yǎng)生物類專業(yè)創(chuàng)新型本科人才和研究生方面起著關鍵作用。本文主要探討生物物理研究機構在高等農(nóng)業(yè)院校生物類專業(yè)創(chuàng)新型本科生與研究生培養(yǎng)方面所起的作用。研究所發(fā)展目標生物物理研究所是現(xiàn)代農(nóng)學、生物學和物理學等交叉科學的重要研究基地和人才培養(yǎng)基地。研究所瞄準21世紀農(nóng)業(yè)生物物理學中具有基礎性、前沿性的重大理論和工程技術難題,聯(lián)系與人類生存與健康相關的重大需求,發(fā)揮多學科交叉綜合的優(yōu)勢,充分利用國家政策與科研基金的支持,以農(nóng)業(yè)科學與工程研究中的農(nóng)業(yè)增產(chǎn)增質(zhì)、農(nóng)產(chǎn)品的貯藏與保鮮、農(nóng)業(yè)信息的檢測與加工、農(nóng)業(yè)蟲害的發(fā)現(xiàn)與防治、農(nóng)業(yè)環(huán)境的保護與治理等問題為核心,大力開展農(nóng)業(yè)生物過程中

17、有關物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換和信息傳遞等關鍵領域的一系列原創(chuàng)性研究工作,力圖開發(fā)出"兩優(yōu)一高"的農(nóng)產(chǎn)品,為我國持續(xù)農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化做出有力貢獻。與此同時,重點關注研究所在本科創(chuàng)新人才和研究生專業(yè)人才的培養(yǎng)上面,并力圖將人才培養(yǎng)同科學研究統(tǒng)一起來,在培養(yǎng)農(nóng)業(yè)生物物理專業(yè)人才的基礎上,逐步增強我國的農(nóng)業(yè)生物物理學科研實力和學術影響力。實驗條件建設實驗條件建設主要包含了科研場所和儀器設備的建設,是研究機構進行科學項目研究、科技創(chuàng)新與開發(fā)、本科生創(chuàng)新教育與研究生科研培訓的必要設施。首先,根據(jù)學?？蒲衅脚_的設備狀況,結合研究機構的發(fā)展規(guī)劃與現(xiàn)有科研人員的研究水平和興趣點,制定詳細的儀器購置計劃

18、;對能夠保證研究機構特點的大型儀器給予重點考慮,關注高端儀器的時效性和共享性,極力避免大型高端設備重復購置,應充分考慮到校級平臺和周圍高校與科研院所科研平臺的共享可能性。對于小型、廉價、有較高利用率的制備型和分析型儀器則應盡可能地配置齊全,也可以考慮校內(nèi)、院內(nèi)和所內(nèi)重復購置,甚至可以根據(jù)實際需要在研究所和課題組內(nèi)制定多臺的購置計劃,以便課題前期基礎試驗的順利進行。另外,對于大型高精尖儀器設備應著重考慮國際知名品牌的先進產(chǎn)品,而小型的常規(guī)儀器可考慮國內(nèi)知名的廠家提供的產(chǎn)品,但不管是什么樣的儀器設備,購買時一定要考慮到產(chǎn)品的售后服務和技術保障。其次,需對實驗室空間進行合理布局和分配。比如,我所根據(jù)

19、生物物理學科特點和科研人員的研究興趣,主要建設4個研究室:環(huán)境與輻射生物物理研究室、分子與細胞生物物理研究室、生物物理新技術新方法研究室、理論生物物理研究室。其中,前3個研究室需要大型儀器設備的支撐,主要承擔所內(nèi)和校內(nèi)的實驗性課題研究、研究生學位論文實驗及高年級本科生的專業(yè)實驗教學等。環(huán)境與輻射生物物理研究室是研究所的主題性基礎實驗室,物理環(huán)境的調(diào)控裝置在該室的核心地位十分明顯,各種類型的高壓電場電源、高強度脈沖磁場源、超聲波發(fā)生器、同位素核輻射源和激光發(fā)生器等應具有一定建設規(guī)模。分子與細胞生物物理研究室和生物物理新技術新方法研究室是研究所的核心分析性實驗室,各種新型儀器裝置在這兩個研究室的核

20、心位置非常突出。為突出學科特點,針對學校的設備現(xiàn)狀和必要性,重點購置生物物理新技術設備,比如我所就制定了重點購置核磁共振成像儀、掃描探針顯微鏡、X射線晶體衍射儀、激光光鑷、差示量熱掃描儀、膜片鉗、流式細胞計數(shù)儀、人工拉膜機的計劃,這些設備必將成為整個研究所的核心裝備。最后,理論生物物理研究室將負責整個研究所甚至校內(nèi)的相關實驗數(shù)據(jù)的后期處理、統(tǒng)計分析和模型建立,購買必要的數(shù)據(jù)庫和一定的存儲、運算裝置(高速計算機)與軟件(生物信息學、計算生物學、理論物理學)是十分必要的?？傮w上,研究所儀器的購買除了要注重研203究所的學科特點外,也應考慮到這些儀器設備的校內(nèi)共享可能性。研究所在創(chuàng)新人才培養(yǎng)中的作用校內(nèi)研究所承擔著課題研究和科研人才培養(yǎng)的雙重任務,這是科學發(fā)展過程中互相促進的兩個層面?？蒲腥瞬排囵B(yǎng)的意義在于科學研究的創(chuàng)新力,在于科學知識的傳承和科研精神的光大,研究所應該成為"教、學、研"的重要平臺。本科創(chuàng)新人才培養(yǎng)高校研究所的科研人員往往屬于教學科研型教師系列,在從事科學研究的同時,還必須承擔一定課時量的本科教學工作。在國家大力倡導創(chuàng)新教育的背景下,如何把