神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元的研究進(jìn)展

1、神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元的研究進(jìn)展 碩士研究生 孫曉靜 導(dǎo)師 孫莉 傳統(tǒng)的觀點認(rèn)為，"中樞神經(jīng)細(xì)胞不可再生"，然而自1992年 Reynolds等從成年鼠腦紋狀體和海馬中首次分離出了神經(jīng)干細(xì)胞（NSC） ,且它與多能干細(xì)胞一樣具有自我更新、分裂增殖、多向分化的潛能，此后人們開始深入了解神經(jīng)干細(xì)胞。Erikson等于1998年也證實了人腦中同樣存在神經(jīng)干細(xì)胞，隨后的研究發(fā)現(xiàn)成年腦中神經(jīng)干細(xì)胞主要存在于側(cè)腦室外側(cè)壁腦室下區(qū)和海馬齒狀回中。隨著近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或病變部位實行細(xì)胞替代或移植治療的研究深入，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病或神經(jīng)退行性疾病等的

2、治療提供了新的方向。 阿爾茨海默病（AD）是老年人常見的一種慢性進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。長期以來認(rèn)為前腦膽堿能投射系統(tǒng)（尤其是Meynert基底核）膽堿能神經(jīng)元變性、細(xì)胞數(shù)量減少等導(dǎo)致AD認(rèn)知功能不可逆的減退。目前就其病因有多種學(xué)說：如基因?qū)W說（APP基因 1 、早老蛋白基因 2 、ApoE基因 3 ）、膽堿能假說、雌激素水平下降學(xué)說4 、氧化應(yīng)激學(xué)說 5 、鋁中毒學(xué)說、炎癥學(xué)說6 、神經(jīng)營養(yǎng)因子學(xué)說7 等。此外，AD還可能與年齡、種族、社會心理因素及各種疾病史等多種因素有關(guān)。 綜上所述, 多因素參與 AD 發(fā)病, 但目前為止確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。其治療方法包括對于輕度和中度 AD 予以乙酰

3、膽堿酯酶(AChE抑制劑以提高認(rèn)知功能, 以及 N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA拮抗劑對重度 AD 的治療8,其他藥物如腦循環(huán)改善藥物劑、 AChE 抑制劑、 M1 膽堿受體激動劑、乙酰膽堿釋放促進(jìn)劑、 神經(jīng)生長因子、 抗氧化藥物和抗 -淀粉樣藥物等。這些治療手段雖能減輕 AD 的癥狀, 但無法補(bǔ)充大腦皮層和海馬大量丟失的神經(jīng)細(xì)胞,因而對中、 晚期AD 患者的療效有限。神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs的廣泛研究及重大進(jìn)展為 AD 的治療提供了一個更有前景的治療策略，NSC移植治療AD等退行性疾病成為近年來的研究熱點。然而不管是誘導(dǎo)、促進(jìn)內(nèi)源性NSCs增殖分化，產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞代替缺損變性的細(xì)胞，還是體外

4、培養(yǎng)需要的NSCs移植入體內(nèi)，如何誘導(dǎo)NSCs定向分化為膽堿能神經(jīng)元都是一個至關(guān)重要的問題。 神經(jīng)干細(xì)胞增殖、分化相關(guān)因素 神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、遷移、分化與多種因素相關(guān)。目前的研究認(rèn)為決定神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的機(jī)制有兩種：一種是細(xì)胞自身基因調(diào)控；另一種是外來因素調(diào)控，主要為各類細(xì)胞因子家族，如神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子、細(xì)胞黏附因子等均可影響神經(jīng)細(xì)胞的分化，其影響機(jī)制各不相同。不同的細(xì)胞因 子誘導(dǎo)分化出的神經(jīng)元不同。研究最多有生長因子如：表皮生長因子（EGF）家族、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）家族、-轉(zhuǎn)導(dǎo)生長因子（-TGF）超家族、神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性生長因子及化學(xué)誘導(dǎo)劑及藥物等。 一、生長因子

5、堿性成纖維生長因子(FGF在神經(jīng)干細(xì)胞增殖的早期階段發(fā)揮促有絲分裂的作用, 使神經(jīng)干組胞獲得對另一作用更強(qiáng)的促有絲分裂因子表皮生長因子（EGF）的反應(yīng)性;而表皮生長因子在神經(jīng)干細(xì)胞增殖后期發(fā)揮作用 9。兩種因子對神經(jīng)干細(xì)胞分化方向的作用也不相同, 堿性成纖維生長因子能增加干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的比例, 而表皮生長因子敏感的干細(xì)胞生成的神經(jīng)元常常少于 1%, 絕大多數(shù)是星形膠質(zhì)細(xì)胞, 且這兩種生長因子作用的神經(jīng)干細(xì)胞分化形成的神經(jīng)元多為 - 氨基丁酸能神經(jīng)元10。Tarasenko 等9比較堿性成纖維生長因子、 表皮生長因子和外源性白血病抑制因子聯(lián)合及單獨應(yīng)用對培養(yǎng)的人胚神經(jīng)干細(xì)胞的影響, 發(fā)現(xiàn)上述

6、 3 種生長因子聯(lián)合應(yīng)用對人胚神經(jīng)干細(xì)胞的擴(kuò)增最有效, 人胚神經(jīng)干細(xì)胞在有堿性成纖維生長因子, 肝素及層粘連蛋白的聯(lián)合作用下往膽堿能神經(jīng)元方向分化。 二、 轉(zhuǎn)化生長因子超家族 骨形成蛋白是轉(zhuǎn)化生長因子超家族中最大成員。在原腸胚期, 骨形成蛋白首先表現(xiàn)為抑制神經(jīng)外胚層的形成; 在神經(jīng)管期,不同濃度的骨形成蛋白和其他細(xì)胞因子共同促進(jìn)神經(jīng)管背部不同類型神經(jīng)細(xì)胞的分化; 在發(fā)育晚期, 作用于腹側(cè)區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞, 抑制這些細(xì)胞分化為神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞, 促進(jìn)其分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞,同時也作用于非腹側(cè)區(qū)的神經(jīng)前體細(xì)胞, 促進(jìn)其存活及分化11。骨形成蛋白 2 可以明顯抑制 Oligr2(促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向

7、神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的一種重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達(dá), 從而抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化12。Varley 等試驗研究證明骨形成蛋白 2 是神經(jīng)嵴細(xì)胞向腎上腺素能神經(jīng)元分化的有效調(diào)節(jié)物13。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中, 骨形成蛋白 2 在室管膜區(qū)表面有表達(dá), 可以啟動VZ 內(nèi)的新皮層前體神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)元分化。體外培養(yǎng)的神經(jīng)上皮細(xì)胞在骨形成蛋白 2 作用 24 h 之后, 可以增加分化產(chǎn)物中神經(jīng)元數(shù)目, 提示骨形成蛋白 2 能夠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。 三、 神經(jīng)營養(yǎng)因子、腦源性生長因子 神經(jīng)營養(yǎng)因子刺激鳥類神經(jīng)管前體細(xì)胞分化為運(yùn)動神經(jīng)元, 但對分化的離體運(yùn)動神經(jīng)元的存活總數(shù)則無明顯影響。但是神經(jīng)營養(yǎng)因子

8、對細(xì)胞分化的影響似乎是通過促進(jìn)已分化的神經(jīng)細(xì)胞的成熟, 而不是使未分化的多能干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。腦源性生長因子、 胰島素樣生長因子、 血小板源性生長因子等被證實增加神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元表型方向的分化。睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子和白血病抑制因子作用于 多潛能神經(jīng)干細(xì)胞, 誘導(dǎo)它們分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞;而甲狀腺素 T3 則促使其分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞 14。Kim 等15研究表明, 粒- 巨噬細(xì)胞集落刺激因子可促進(jìn)神經(jīng)祖細(xì)胞增殖, 抑制其分化及凋亡。另外, 參與神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的細(xì)胞因子有細(xì)胞因子白細(xì)胞介素類, 如白介素 1具有誘導(dǎo)人神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺神經(jīng)元分化的作用, 聯(lián)合應(yīng)用白介素 1、白介素11、白血病抑制

9、因子和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對人神經(jīng)干細(xì)胞向成熟的多巴胺神經(jīng)元分化具有協(xié)同作用16。 四、化學(xué)誘導(dǎo)劑及藥物 化學(xué)誘導(dǎo)劑被引進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)實驗中并被證實有效, 鄧紅等17分離培養(yǎng)新生大鼠紋狀體脊髓神經(jīng)干細(xì)胞, 觀察不同濃度全反式視黃酸對脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的影響, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)全反式視黃酸誘導(dǎo)脊髓神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化, 其作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性, 脊髓神經(jīng)干細(xì)胞的RAR基因的表達(dá)對全反式視黃酸存在劑量依賴性和時間依賴性。王飛等18用不同濃度(0.5 mol/L、1mol/L、5 mol/L和 10 mol/L的全反式維甲酸在體外誘導(dǎo)人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞, 全反式維甲酸能顯著提高人胚胎神經(jīng)干

10、細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例, 其中1 mol/L的維甲酸誘導(dǎo)人胚胎神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例最高。 目前已知，細(xì)胞因子、生長因子以及內(nèi)環(huán)境等因素的作用可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向不同的終末神經(jīng)細(xì)胞分化，諸如成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞的主要分化方向是-氨基丁酸能神經(jīng)元；鼠膠質(zhì)細(xì)胞源性生長因子于中樞神經(jīng)系統(tǒng)可誘導(dǎo)出多巴胺神經(jīng)元，于周圍神經(jīng)系統(tǒng)可產(chǎn)生施萬細(xì)胞；白細(xì)胞抑制因子與多巴胺能神經(jīng)元生成相關(guān)19 。膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子GDNF在NSC分化為多巴胺神經(jīng)元中起重要作用 20 .神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中BDNF能增加EGF誘導(dǎo)增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞向GABA（-氨基丁酸）能神經(jīng)元分化，并且也能刺進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向膽堿

11、能神經(jīng)元分化。 中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)是中樞膽堿能神經(jīng)元及其纖維投射分布的部位，乙酰膽堿（Ach）作為中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的一種重要遞質(zhì)，參與學(xué)習(xí)和記憶等相關(guān)的生理活動。大腦退行性變的疾病常引起中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)受損并導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶等高級神經(jīng)功能障礙，這是AD等疾病重要的發(fā)病機(jī)制。 膽堿能神經(jīng)相關(guān)的細(xì)胞因子 一、 神經(jīng)營養(yǎng)因子（NGF） NGF由中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)合成、分泌，反過來支持和營養(yǎng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此對神經(jīng)營養(yǎng)因子對膽堿能神經(jīng)的保護(hù)和維持作用的研究很多。NGF在腦內(nèi)的主要 作用部位是基底前腦膽堿能神經(jīng)系統(tǒng),能促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元發(fā)育,增強(qiáng)突觸的可塑性和神經(jīng)元的功能,使膽堿能神經(jīng)細(xì)胞中的Ach、

12、ChAT 和AchE等活性增強(qiáng),并促進(jìn)其存活和纖維的延伸21 ,22。研究表明,若注射 NGF抗阻斷NGF與其受體的結(jié)合,基底前腦膽堿能神經(jīng)元的 ChAT 和 AchE活性會明顯下降22。此外Calza 等23在損毀基底前腦膽堿能神經(jīng)元后, 于側(cè)腦室注射 EGF 和 bFGF 14 d后, 再改用 NGF 注射 14 d, 結(jié)果除發(fā)現(xiàn)基底前腦膽堿能神經(jīng)元受損大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能得到明顯改善外, 形態(tài)學(xué)也證實腦內(nèi)海馬等處有較多的神經(jīng)干細(xì)胞被 NGF 誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元。也有實驗結(jié)果24發(fā)現(xiàn) NGF 可誘導(dǎo)皮層和隔區(qū)來源的神經(jīng)干細(xì)胞向成熟的 AChE 陽性的膽堿能神經(jīng)元分化。且隔區(qū)來源的神經(jīng)干細(xì)

13、胞比皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞更易于向AChE 陽性神經(jīng)元分化, 這可能是因為隔區(qū)來源的神經(jīng)干細(xì)胞具有更易于向膽堿能神經(jīng)元分化的區(qū)域特異性。 BDNF作為一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子亦有眾多的研究報導(dǎo)，神經(jīng)干細(xì)胞的增殖首先需要有絲分裂原的作用,表面生長因子 ( EGF和堿性成纖維細(xì)胞生長因子 ( bFGF是神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖的重要的有絲分裂原 ,并且多數(shù)研究認(rèn)為 bFGF與 EGF分別在胚胎發(fā)育早晚期促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖 ,并可促神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)前體細(xì)胞、 膠質(zhì)前體細(xì)胞分裂 25 ,而 BDNF在定向祖細(xì)胞分化成終末細(xì)胞中起重要作用 26 。BDNF在體外可促進(jìn) NSC的存活和促進(jìn)其向神經(jīng)元分化。諸如林

14、玲等人 27通過體外培養(yǎng)出生 23d大鼠腦皮質(zhì)的神經(jīng)干細(xì)胞 ,應(yīng)用免疫熒光術(shù)分別觀察 BDNF組和對照組中2tubulin陽性神經(jīng)元數(shù) ,結(jié)果發(fā)現(xiàn) BDNF組陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對照組 ,且神經(jīng)元的突起明顯較對照組長。謝青松等人 28 利用孕 14d大鼠胚胎腦組織中的神經(jīng)干細(xì)胞在體外加入BDNF誘導(dǎo)分化 1、3、和 5d后行流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn): BDNF組神經(jīng)元的比例較對照組各時段的比例提高了 1倍。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能主要依賴于神經(jīng)元 ,不同類型的神經(jīng)元其功能也不同 ,而神經(jīng)元的種類是按神經(jīng)遞質(zhì)來區(qū)分的。研究已證實 BDNF能增加 EGF誘導(dǎo)增殖的神經(jīng)前體細(xì)胞向 GABA(-氨基丁酸 能神經(jīng)元分

15、化 ,并且也能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞向膽堿能神經(jīng)元分化。這為外源性神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞性疾病提供了依據(jù)。 二、 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP） BMPs是轉(zhuǎn)化生長因子超家族最大的成員，也是影響神經(jīng)發(fā)育的重要基因組之一，BMPs從神經(jīng)發(fā)生到神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育成熟的不同時期、不同腦區(qū)均起著相當(dāng)重要的作用。2000 年 , Lgnacio等 29 報道,在培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中, 骨形態(tài)發(fā)生蛋白9 (BMP9直接誘導(dǎo)編碼乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶和乙酰膽堿轉(zhuǎn)動囊基因的表 達(dá)及上調(diào)乙酰膽堿的合成 , 腦室內(nèi)注射 BMP9 可增加活體的乙酰膽堿水平, 說明BMP9 是膽堿能中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化因子。BMP家族中的 BMP4 也具有相應(yīng)的效

16、應(yīng)。BMPs在不僅神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中有多種作用 , 且對神經(jīng)營養(yǎng)因子的作用產(chǎn)生影響 30 。不同濃度的BMPs對不同時期 NSCs 的分化具有不同作用。如在 E16大鼠的皮層 , 1 - 10ng/ mL BMPs可以促進(jìn)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的分化 , 100ng/ mL則使細(xì)胞死亡 31 。常艷 32 等人所做實驗用表皮生長因子( EGF和成纖維生長因子(FGF將 NSCs 體外擴(kuò)增進(jìn)入分化階段后，再給予一定濃度的BMP4 誘導(dǎo) NSCs的分化方向 , 提高 ChAT的表達(dá) , 促進(jìn) NSCs 向膽堿能神經(jīng)元方向的分化。結(jié)果顯示免疫熒光染色加BMP4培養(yǎng)的實驗組的 ChAT陽性細(xì)胞明顯比不加B

17、MP4培養(yǎng)的對照組的陽性細(xì)胞多 , 而且熒光較強(qiáng); 流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果也提示實驗組 ChAT陽性細(xì)胞率顯著高于對照組( P < 0. 05 ;而 ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志性酶。所以這項實驗可提示BMP4對NSCs 確實具有膽堿能誘導(dǎo)分化作用。有實驗研究觀察發(fā)現(xiàn)不同濃度BMP4對端腦膽堿能前體細(xì)胞的產(chǎn)生和分化也有不同的影響,研究證實低濃度（20g/L）BMP4可誘導(dǎo)端腦膽堿能前體細(xì)胞發(fā)生和分化，而較高濃度（40g/L）BMP4可抑制其發(fā)生和分化 33 。 上述具有膽堿能誘導(dǎo)分化作用的細(xì)胞因子的研究進(jìn)展，對于誘導(dǎo)NSCs定向分化為膽堿能神經(jīng)元技術(shù)的完備有重大意義，是神經(jīng)干細(xì)胞用于治療AD等

18、引起的腦損傷或神經(jīng)元缺損很有必要的基礎(chǔ)研究。然而如何誘導(dǎo)NSCs在病變部位定向分化為膽堿能神經(jīng)元，或者如何將保證體外誘導(dǎo)生成的膽堿能神經(jīng)元的存活率及質(zhì)量并將其順利送達(dá)神經(jīng)元損傷部位，這些是研究者們需要更進(jìn)一步探討的問題。 參考文獻(xiàn) 1 Postina R , Schroeder A , Dewachter I ,et al . A disintegrin - metallo2 proteinase prevents amyloid plaque formation and hippocampal defects in an Alzheimer disease mouse model J . J

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