食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)

1、食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)    【摘要】  目的 建立食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型。方法 采用腹腔注射雞卵清蛋白（OVA）基礎(chǔ)致敏聯(lián)合食管酸灌注的方法處理SD大鼠，并采用免疫組織化學(xué)方法和顯微圖像分析技術(shù)評(píng)價(jià)內(nèi)臟高敏感性-食管化學(xué)刺激大鼠模型的可靠性。 結(jié)果 OVA基礎(chǔ)致敏聯(lián)合食管酸灌注組大鼠被激活了一個(gè)復(fù)雜而廣泛的大腦網(wǎng)絡(luò)，其在額頂皮質(zhì)、島葉、扣帶皮質(zhì)、中央杏仁核、K?lliker-Fuse核、疑核、臂旁核、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、三叉旁核、孤束核、最后區(qū)、延髓網(wǎng)狀核等Fos樣免疫活性（FLI）神經(jīng)元的數(shù)目均顯著高于其余各組（P0.

2、05）。模型組大鼠在中央杏仁核、臂旁核、室旁核、三叉旁核、孤束核的FLI陽性產(chǎn)物的平均光密度 (OD) 值亦較其余各組明顯增高（P0.05）。結(jié)論 預(yù)先腹腔注射雞卵清蛋白基礎(chǔ)致敏聯(lián)合食管酸灌注可成功建立食管內(nèi)臟高敏感性動(dòng)物模型。 【關(guān)鍵詞】  內(nèi)臟高敏感性；c-fos；免疫組織化學(xué)；食管酸灌注；卵清蛋白基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30700362）Establish and evaluation of the rat model of esophageal visceral hypersensitivityAbstract: Objective   To

3、establish a reliable rat model of esophageal visceral hypersensitivity. Methods   Healthy Sprague-Dawley (SD) rats received basal ovalbumin-sensitized combined with intra-esophageal mucosal acid exposure. The neuronal expressions of c-fos proto-oncogene were detected with immunohistochemic

4、al counter-staining and computerized color image analyzer. Results   The basic ovalbumin-sensitized plus esophageal acid perfusion in model group initiated a high density expression of c-fos-immunoreactive (Fos-IR) neurons in multineuronal networks. A significantly higher number of Fos pos

5、itive neurons was found in the model group than those in the corresponding regions of other groups（P0.05）in the following brain areas: frontal and parietal cortex, insular cortex, cingulated cortex, central amygdaloid nucleus,the K?lliker-Fuse nucleus, the nucleus ambiguus, parabrachial nucleus, hyp

6、othalamic paraventricular nucleus, paraventricular thalamic nucleus, paratrigeminal nucleus, the nucleus of solitary tract, area postrema, reticular nucleus of medulla,The OD values of Fos-IR neurons were also increased in the central amygdala , parabrachial nucleus, paraventricular nucleus, the par

7、atrigeminal nucleus and NTS in the model group than that in the corresponding regions of other groups（P0.05）.Conclusion   The reliable rat model of esophageal visceral hypersensitivity has been established.    Keywords: visceral hypersensitivity; c-fos; immunohistochemistry;

8、 esophageal acid perfusion; ovalbumin慢性食管內(nèi)臟高敏感性可能是某一亞類的非糜爛性反流病(NERD)發(fā)生的最重要病理生理特征，是這類患者癥狀產(chǎn)生的基礎(chǔ)和癥狀多樣化的原因1-2。目前，尚不清楚中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中哪些核團(tuán)及環(huán)路參與了食管內(nèi)臟高敏感性的應(yīng)答和調(diào)節(jié)，亦不明了在內(nèi)臟高敏感狀態(tài)下哪些結(jié)構(gòu)對(duì)食管化學(xué)刺激反應(yīng)敏銳，且在人體開展CNS內(nèi)形態(tài)學(xué)-功能的定位研究非常困難。因此，采用有效的動(dòng)物模型來研究?jī)?nèi)臟敏感性改變的中樞敏化機(jī)制有著十分重要的意義。1  材料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組     成年健康SD

9、大鼠29只，雌雄不限，體質(zhì)量225285 g，由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將SD大鼠隨機(jī)分為組，A組：空白對(duì)照組6只；組：食管酸灌注組8只；組：OVA致敏組7只；組：OVA及食管酸灌注組8只。1.2  方法1.2.1  食管酸灌注的方法    在實(shí)驗(yàn)的第14天，對(duì)C組、D組動(dòng)物進(jìn)行食管酸灌注。麻醉動(dòng)物平臥位固定，頭部抬高20°30°，切開腹壁和胃壁，將一引流管放置在賁門處以收集從食管滴注的液體。把一單腔灌流管經(jīng)口放置于食管內(nèi)，導(dǎo)管開口位于食管和胃交界處上23 cm，固定導(dǎo)管，另一端與持續(xù)灌注泵相連。使用0.1 mol/L鹽酸滴注

10、，滴注液溫度保持37 ，速度10 mL/h，共50 min。1.2.2  腦組織切片的制備    食管酸灌注后30 min深度麻醉動(dòng)物后立即開胸，經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管并加壓灌注200 mL生理鹽水沖洗全身血液，隨后用預(yù)冷的4 含4%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PB，pH7.4)500 mL加壓灌注固定1 h。然后取脊髓和全腦組織置于相同固定液中，在4 條件下固定1820 h，再移至含20蔗糖的0.1 mol/L PB溶液中浸泡過夜至下沉（4 ）。用恒冷箱冰凍切片機(jī)-20 行連續(xù)冠狀切片，片厚40 m，隔5取2，切片貼于經(jīng)APES處理的載

11、玻片上備用。1.2.3  Fos表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色    用含0.01 mol/L正常小牛血清、0.5% Triton X的PBS液室溫下孵育2 h；滴加兔多克隆抗c-fos抗體稀釋液（12 000，Oncogen公司），4 孵育48 ；滴加二抗，SuperPicTure即用型二步法檢測(cè)試劑盒（由上海藍(lán)創(chuàng)生物公司提供）在37 孵育1015 min；DAB/H2O2法呈色；最后進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片、光鏡觀察。1.2.4  Fos陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)方法    用日本Olympus BX-50光學(xué)顯微鏡觀察，然

12、后用江蘇捷達(dá)科技提供的顯微圖像分析系統(tǒng)處理并計(jì)算出各腦區(qū)及神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)Fos蛋白陽性細(xì)胞數(shù)量的總和。1.2.5  數(shù)據(jù)處理    應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析比較各組間數(shù)值差異顯著性，P0.05有顯著性差異。2  結(jié)果    各組CNS內(nèi)FLI神經(jīng)元計(jì)數(shù)，從表1可看出：B組大鼠的中央杏仁核、KF核群、下丘腦室旁核、下丘腦視上核、丘腦室旁核、臂旁核、疑核、三叉旁核、孤束核中央亞核和最后區(qū)等核團(tuán)陽性細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表1，P0.05），而額頂葉皮質(zhì)則僅有少數(shù)FLI顆粒。C組在額葉皮質(zhì)、區(qū)

13、、扣帶回皮質(zhì)、區(qū)，及中央杏仁核、下丘腦室旁核、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)、中尾段延髓的孤束核內(nèi)側(cè)亞核背側(cè)和最后區(qū)內(nèi)有中等密度的Fos陽性神經(jīng)元表達(dá)，且與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。D組大鼠額頂葉皮質(zhì)(圖1)、島葉、扣帶回、中央杏仁核、KF核群、疑核、臂旁核、下丘腦室旁核、丘腦室旁核、三叉旁核、孤束核、最后區(qū)、延髓網(wǎng)狀核等核團(tuán)(圖2)FLI神經(jīng)元的數(shù)目較單純的食管酸灌注組和OVA致敏組顯著增加（P0.05）。 表1  四組大鼠不同腦區(qū)和核團(tuán)Fos陽性神經(jīng)元的數(shù)量比較（略）*：與A組比較，P0.05；#：與A組比較，P0.05；:B組和C組比較，P0.01a:×40; b:×

14、200; :棕褐色顆粒為核染色陽性細(xì)胞圖1  OVA致敏聯(lián)合食管酸灌注大鼠前額葉皮質(zhì)Fos表達(dá)（略）a:×40; b:×100; :棕褐色顆粒為核染色陽性細(xì)胞圖2  OVA致敏聯(lián)合食管酸灌注大鼠在延髓內(nèi)臟帶內(nèi)有Fos密集分布（略）3  討論    本研究采用預(yù)先腹腔注射卵清蛋白基礎(chǔ)致敏后再進(jìn)行食管酸灌注的方法來制備食管內(nèi)臟高敏感性大鼠模型，并采用免疫組織化學(xué)方法評(píng)估模型可靠性。c-fos原癌基因及其編碼的相關(guān)蛋白可作為研究神經(jīng)傳導(dǎo)通路或腦的功能活動(dòng)的一個(gè)有意義的標(biāo)志物，亦可作為中樞神經(jīng)對(duì)傷害性刺激反應(yīng)的疼痛標(biāo)志物，

15、可用來判斷、追蹤傷害性刺激信號(hào)的傳導(dǎo)通路，其表達(dá)部位常常是與傷害性信息傳遞、中繼或整合有關(guān)的區(qū)域。c-fos還可以作為第三信使接受細(xì)胞外刺激的短程信息，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能變化，因而c-fos在神經(jīng)系統(tǒng)可塑性方面扮演著重要的角色3-4。近年來在神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)定位和功能活動(dòng)相結(jié)合的研究中得到了廣泛應(yīng)用，已在內(nèi)臟痛覺過敏的神經(jīng)機(jī)制的研究中得到應(yīng)用5-7。Fos蛋白形態(tài)學(xué)顯示方法的建立也為研究感覺刺激信息的傳導(dǎo)通路提供了一個(gè)快捷、敏感和方便的研究手段。雖然結(jié)果是通過形態(tài)學(xué)方法顯示，但在某種程度上反映了一定的功能意義，是一種形態(tài)學(xué)和功能學(xué)相結(jié)合的指標(biāo)。    作者發(fā)現(xiàn)，預(yù)先腹腔

16、注射卵清蛋白基礎(chǔ)致敏后再進(jìn)行食管酸灌注激活了一個(gè)復(fù)雜而廣泛的大腦網(wǎng)絡(luò)，CNS內(nèi)從皮質(zhì)至延髓有廣泛的Fos蛋白表達(dá)，且在多個(gè)部位Fos陽性細(xì)胞數(shù)目比單純的食管酸灌注組或卵清蛋白致敏組明顯增多并集中分布，且所激活的腦區(qū)更多，多數(shù)為深染。這表明卵清蛋白基礎(chǔ)致敏對(duì)食管酸灌注誘發(fā)的CNS內(nèi)Fos表達(dá)有活化作用，增加了多個(gè)腦區(qū)的FLI神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)和增強(qiáng)c-fos基因表達(dá)的強(qiáng)度。此項(xiàng)結(jié)果表明慢性的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)可能易化了某種痛覺傳遞過程并促進(jìn)了食管內(nèi)臟的痛覺過敏形成，并由此導(dǎo)致CNS疼痛“標(biāo)志物”Fos蛋白表達(dá)的增強(qiáng)，也提示采用腹腔注射雞卵清蛋白致敏聯(lián)合食管酸灌注來制備內(nèi)臟高敏感性大鼠模型是可行和成功的?！?/p>

17、參考文獻(xiàn)】  1 Hong SJ，Ko BM，Jung IS，et al.Relevance of ineffective esophageal motility and hyperactive acid sensitization in patients with gastroesophageal refluxJ.J Gastroenterol Hepatol，2007,22(10):1662-1665.2 Ringel Y.New directions in brain imaging research in functional gastrointestinal disorde

18、rsJ.Dig Dis，2006,24(3-4):278-285.3 Song GH,Venkatraman V,Ho KY,et al.Cortical effects of anticipation and endogenous modulation of visceral pain assessed by functional brain MRI in irritable bowel syndrome patients and healthy controlsJ.Pain，2006，126(1-3):79-90.4 Hobson AR,Furlong PL,Worthen SF,et al.Real-time imaging of human cortical activity evo