第一節(jié)核酸的分離純化

1、 分子生物學(xué)研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法、特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進步。DNA分子的切割與連接分子的切割與連接核酸分子雜交核酸分子雜交凝膠電泳凝膠電泳細胞轉(zhuǎn)化細胞轉(zhuǎn)化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因操作基因操作基因的定點突變基因的定點突變PCR擴增等擴增等核心技術(shù)核心技術(shù)1、理論上的三大成就2、技術(shù)上的二大發(fā)明三大成就三大成就 ：1.1. 40 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因基因的分子載體是的分子載體是DNADNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)

2、問題；的物質(zhì)基礎(chǔ)問題；1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae1952年年Hershey和和Chase證實噬菌體證實噬菌體DNA侵染細菌侵染細菌實驗實驗2.2. 50 50年代揭示了年代揭示了DNADNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復(fù)制保留復(fù)制機制機制, ,解決了基因的自我復(fù)制和世代交解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問題；替問題；X-ray sourceCrystallized DNARosalind Franklin拍出拍出 了第一

3、張了第一張能反映能反映DNA美麗雙螺旋結(jié)構(gòu)的美麗雙螺旋結(jié)構(gòu)的X射線照片射線照片 Maurice WilkinsPhotographicfilmDescription of the 3-D structure of DNAFrancis Crick & James Watson三位科學(xué)家因為對這一 成果的貢獻，共享1962年的諾貝爾生物學(xué)獎 Conservative ModelSemiconservative ModelFrank StahlMatt MeselsonParent cellFirst replicationSecond replication3.3. 50 50年代末至年

4、代末至6060年代，相繼提出了年代，相繼提出了 中心法則中心法則 和操和操縱子學(xué)說縱子學(xué)說, ,成功地成功地破譯了遺傳密碼破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳，充分認識了遺傳信息的流動和表達。信息的流動和表達。Jacob and Monod但是，如果沒有分離和富集單但是，如果沒有分離和富集單一一DNADNA分子的技術(shù)，科學(xué)家就無分子的技術(shù)，科學(xué)家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析。分析。 兩大兩大技術(shù)保證：技術(shù)保證：1.DNA1.DNA的體外切割和連接的體外切割和連接19621962年年Arber Arber 發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert

5、1967Gellert發(fā)現(xiàn)了發(fā)現(xiàn)了 DNA DNA 連接酶（連接酶（DNA ligase DNA ligase ）Herbert Boyer,Herbert Boyer,Stanley CohenStanley Cohen19721972年獲得年獲得第一第一個重組個重組DNADNA分子分子( (實現(xiàn)不同來源實現(xiàn)不同來源DNADNA的重組的重組) )Herbert BoyerProduced first recombinant DNA using EcoRIEcoRI recognition sites phage DNAEcoRI cuts DNA into fragmentsSticky e

6、ndSV40 DNAThe two fragments stick together by base pairingDNA ligaseRecombinant DNATransform E. coli with recombinant plasmidStanley Cohen & Annie ChanHerbert BoyerKanamycin resistance genePlasmid pSC101Tetracycline resistance geneE. coli transformed with recombinant plasmidTransformed cells pla

7、ted onto medium with kanamycin and tetracyclineOnly cells with recombinant plasmid survive to produce colonies2.DNA2.DNA的核苷酸序列分析技術(shù)的核苷酸序列分析技術(shù) DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基核苷酸序列分析法是在核酸的酶學(xué)和生物化學(xué)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的礎(chǔ)上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，技術(shù)學(xué)，這門技術(shù)，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，以及克隆DNA片斷的操作方

8、面，都有著十分廣泛的使用價值。片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。General process of gene engineering1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復(fù)制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4. 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因。5.5. 將目的基因克隆到將目的基因克隆到表達載體表達載體上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在上，導(dǎo)入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下

9、實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關(guān)系。之間的關(guān)系。 前言前言一、核酸分離、純化原則一、核酸分離、純化原則（一）（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性（二）（二）防止核酸的生物降解防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟二、分離提取核酸的主要步驟（一）（一）細胞的破碎細胞的破碎（二）（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）（三）核酸的沉淀核酸的沉淀 ( (四）四）核酸的濃度測定核酸的濃度測定（五）（五）核酸的保存核酸的保存 核酸核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者

10、，是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。前前 言言（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性（一）保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1 1 意義意義 遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，核酸的的級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其級結(jié)構(gòu)還決定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。他生物大分子結(jié)合的方式。 2 2 分離核酸原則：分離核酸原則：

11、1 1）溫度）溫度不要過高；不要過高； 2 2）控制一定的控制一定的pHpH值值范圍范圍(pH(pH值值5-9); 5-9); 3 3）保持一定的保持一定的離子強度離子強度; ; 4 4）減少物理因素對核酸降解的減少物理因素對核酸降解的機械剪切力機械剪切力. . 細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫所用器械和一些試劑需高溫滅菌滅菌，提取緩，提取緩沖液中需加沖液中需加核酸酶抑制劑核酸酶抑制劑。1 1） 金屬離子螯合劑：金屬離子螯合劑： DNADNA酶需要金屬二價離子酶

12、需要金屬二價離子MgMg2+2+、CaCa2+2+的激活，因的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNADNA酶活性。酶活性。如如EDTA-NaEDTA-Na2 2( (乙二胺四乙酸二鈉乙二胺四乙酸二鈉) )、8-8-羥基喹啉；羥基喹啉；2 2） 陰離于型表面活性劑：陰離于型表面活性劑： 如如SDSSDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。的復(fù)合物，該復(fù)合物在高鹽溶液中沉淀。 RNAase分布廣泛，極易污染樣

13、品，而分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（皂土（bentonite ） 作用機制：作用機制：皂土帶負電荷，能皂土帶負電荷，能吸附吸附RNase，使其失活。使其失活。 (2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。 作用機制：作用機制：與蛋白質(zhì)中與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。結(jié)合使蛋白變性。 使用注意：使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大但濃度

14、比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。倍。 2）容易降解，保存在）容易降解，保存在4 或液氮中；或液氮中； 3）提）提RNA時，時，0.1% DEPC浸泡器皿浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒）劇毒。（3) 3) 肝素肝素（4 4）復(fù)合硅酸鹽（）復(fù)合硅酸鹽（Macaloid)Macaloid)（5 5）RNaseRNase阻抑蛋白（阻抑蛋白（RNasinRNasin）（6 6）氧釩核糖核苷復(fù)合物）氧釩核糖核苷復(fù)合物 (Vanadyl-(Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC)Ribonucleoside Complex, VRC)（一）細胞的破碎（一）細胞的破碎

15、 1 1 高速組織搗碎機搗碎高速組織搗碎機搗碎 2 2 玻璃勻漿器勻漿玻璃勻漿器勻漿 3 3 超聲波處理法超聲波處理法 4 4 液氮研磨法液氮研磨法 5 5 化學(xué)處理法化學(xué)處理法(SDS(SDS、LDSLDS，吐溫，吐溫8080等）等） 6 6 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）生化法（溶菌酶、纖維素酶等）（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力吸力( (核酸與堿性蛋白的結(jié)合核酸與堿性蛋白的結(jié)合) )、氫鍵和非、氫鍵和非極性的范德華力。極性的范德華力。 分離核酸分離核酸最困難最困難的是將與核酸緊密結(jié)

16、合的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。 常用方法：常用方法： 1 加入濃鹽溶液（如加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸核酸-蛋白質(zhì)加入蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2 加入加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能； 3 酚酚/氯仿抽提氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。并對核酸酶有抑制作用。 氯仿比重

17、大，能加速有機相與水相分層，減氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。素和蔗糖的作用。 在酚在酚/ /氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為為防止起泡和促使水相與有機相的分離防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一，再加上一定量的異戊醇（定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉酚：氯：異戊醉=25=25：2424：1 1）。 1 1）使用注意）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如紅色或

18、黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。 2 2）安全操作）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。應(yīng)戴手套。使用酚時應(yīng)注意使用酚時應(yīng)注意 沉淀是濃縮核酸最常用的方法。沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點優(yōu)點： 改變核酸的溶解緩沖液；改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度；重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。 （1 1）乙醇）乙醇優(yōu)點：優(yōu)點： 對鹽

19、類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。揮發(fā)除去，不影響以后實驗。缺點：缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。需要量大，一般要求低溫操作。優(yōu)點：優(yōu)點： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNADNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點缺點： 易使鹽類、蔗糖與易使鹽類、蔗糖與DNADNA共沉淀異丙醇難以揮共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用發(fā)除去。所以，最后用7070乙醇漂洗數(shù)次。乙醇漂洗數(shù)次。優(yōu)點：優(yōu)點： 可用不同濃度的可用不同濃度的PEGPEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)

20、量選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的的DNADNA片段。應(yīng)用片段。應(yīng)用60006000相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量的的PEGPEG進行進行DNADNA沉淀時，使用濃度與沉淀時，使用濃度與DNADNA片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意： PEGPEG沉淀一般需要加入沉淀一般需要加入0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10mmol/L10mmol/L的的MgClMgCl2 2。要除去。要除去DNADNA沉淀中沉淀中PEGPEG。 精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNADNA。 原理是：原理是： 精胺與精胺與DNADNA結(jié)合后，使結(jié)合后，使DN

21、ADNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與雜質(zhì)與DNADNA分開，達到純化分開，達到純化DNADNA的目的。的目的。 一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與低溫長時間沉淀，易導(dǎo)致鹽與DNADNA共沉淀，共沉淀，影響以后的實驗。一般使用影響以后的實驗。一般使用00冰水，冰水，10-10-15min15min， DNADNA樣品足可達到實驗要求。樣品足可達到實驗要求。 1 1 紫外分光光度法測定紫外分光光度法測定DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提

22、：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。 結(jié)論：結(jié)論：在波長在波長260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度值的吸光度相當于雙鏈相當于雙鏈DNADNA濃度為濃度為50g/ml50g/ml；單鏈；單鏈DNADNA為為37 37 g/mlg/ml；RNARNA為為40 ug/ml40 ug/ml。 DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型

23、而有差異。 對標準樣品來說，濃度為1g / ml時，DNA鈉鹽的OD2600.02當OD2601時，dsDNA濃度約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml原理：核酸在260nm處有最大吸收峰蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰鹽和小分子在230nm處有最大吸收峰OD260/OD2801.7OD260/OD2302.01 OD260=50 g/mL DNAa a吸取一定量的吸取一定量的DNADNA樣品或樣品或RNARNA樣品，加水至特定體積樣品，加水至特定體積 后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。b b分光光度計先用一定

24、量的水分光光度計先用一定量的水校正零點校正零點。c c測定待測樣品在測定待測樣品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值。值。d d計算濃度。計算濃度。 雙鏈雙鏈DNADNA樣品濃度樣品濃度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀釋倍數(shù)核酸稀釋倍數(shù) 50/100050/1000； RNARNA樣品濃度樣品濃度(g/l) = OD(g/l) = OD260260核酸稀釋核酸稀釋倍數(shù)倍數(shù)40/100040/1000。e e分析純度。分析純度。A：測：測DNA： 純的純的DNA樣品樣品OD260/OD280應(yīng)為應(yīng)為1.8，OD260mOD2

25、30應(yīng)大于應(yīng)大于2.0。1) OD260/OD280大于大于1.9時，表明有時，表明有RNA污染。污染。2) 小于小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染；3) OD260/OD230小于小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。注：注： 可能可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的的DNA溶液比值為溶液比值為1.8的情況。的情況。 測定結(jié)果分析測定結(jié)果分析B B：測：測RNARNA 純的純的RNARNA樣品其樣品其OD260OD260OD280OD280應(yīng)介于應(yīng)介于1.7-2.01.7-2.0之之間，間，OD260/OD230OD260/OD230比值應(yīng)大于比值應(yīng)大于2.02.0。1 1）若）若RNARNA樣品樣品OD260/OD280OD260