微生物實驗指導書

1、微生物實驗指導書實驗一普通光學顯微鏡的使用維護一、實驗目的：1、掌握顯微鏡的構造原理及性能。2、熟練掌握顯微鏡的操作方法3、初步了解血球計數(shù)板的使用方法。二、實驗原理：1、顯微鏡的實驗原理：普通光學顯微鏡利用目鏡和物鏡兩組透鏡系統(tǒng)來放大成像，故又常被稱為復式顯微鏡。它們由機械裝置和光學系統(tǒng)兩大部分組成。在顯微鏡的光學系統(tǒng)中，物鏡的性能最為關鍵，它直接影響著顯微鏡的分辨率。而在普通光學顯微鏡通常配置的幾種物鏡中，油鏡的放大倍數(shù)最大，對微生物學研究最為重要。與其他物鏡相比，油鏡的使用比較特殊，需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，這主要有如下二方面的原因： 增加照明亮度   增加顯微鏡的分辨率。

2、2、血球計數(shù)板的構造原理：血球計數(shù)板是一塊特制的厚的載玻片，其上由四條豎槽構成三個平臺，中間較寬的平臺又被一短的橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分為9個大方格，中間的大方格為計數(shù)室。123III1 / 29計數(shù)室的刻度有兩種規(guī)格即16×25或25×16的。現(xiàn)在常用25×16的，即計數(shù)室（一個大方格）分成25個中方格，每個中方格由分為16個小方格。左上右上中心左下右下三、材料與儀器：1、儀器：顯微鏡 、載玻片、蓋玻片、牙簽、血球計數(shù)板2、材料：擦鏡紙、元蔥四、實驗步驟：2 / 29（一）顯微鏡練習：1、制片：用牙簽挑少許元蔥表皮放在載玻片上

3、，然后加蓋蓋玻片。2、觀察：低倍鏡 高倍鏡（二）血球計數(shù)板的練習：先用低倍鏡查找中方格，再用高倍鏡查找小方格，按照左上、左下、右上、右下、中心格練習。實驗二 革蘭氏染色法一、目的要求了解革蘭氏染色的原理，學習并掌握革蘭氏染色的方法。二、基本原理革蘭氏染色反應是細菌分類和鑒定的重要性狀。它是1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立的。革蘭氏染色法（Gram stain）不僅能觀察到細菌的形態(tài)而且還可將所有細菌區(qū)分為兩大類：染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；染色反應呈紅色（復染顏色）的稱為革蘭氏陰性細菌，用G-表示。細菌對于革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。革

4、蘭氏陽性細菌的細胞壁主要是由肽聚糖形成的網(wǎng)狀結構組成的，在染色過程中，當用乙醇處理時，由于脫水而引起網(wǎng)狀結構中的孔徑變小，通透性降低，使結晶紫-碘復合物被保留在細胞內而不易脫色，因此，呈現(xiàn)藍紫色；革蘭氏陰性細菌的細胞壁中肽聚糖含量低，而脂類物質含量高，當用乙醇處理時，脂類物質溶解，細胞壁的通透性增加，使結晶紫-碘復合物易被乙醇抽出而脫色，然后又被染上了復染液（番紅）的顏色，因此呈現(xiàn)紅色。三、器材大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌；革蘭氏染色液、載玻片、蓋玻片、接種環(huán)、顯微鏡、擦鏡紙等。四、操作步驟1涂片：將培養(yǎng)1416小時的枯草芽孢桿菌和培養(yǎng)24小時的大腸桿菌分別作涂片（注意涂片切不可過于濃

5、厚），干燥、固定。固定時通過火焰12次即可，不可過熱，以載玻片不燙手為宜。3 / 292染色（1）初染 加草酸銨結晶紫一滴，約一分鐘，水洗。（2）媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆蓋約一分鐘，水洗。（3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時為止，約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精。（4）復染 用番紅液染12分鐘，水洗。（5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽性菌呈紫色。以分散開的細菌的革蘭氏染色反應為準，過于密集的細菌，常常呈假陽性。革蘭氏染色的關鍵在于嚴格掌握酒精脫色程度，如脫色過度，則陽性菌可被誤染為陰性菌；而脫色不夠時，陰性菌可被

6、誤染為陽性菌。此外，菌齡也影響染色結果，如陽性菌培養(yǎng)時間過長，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈陰性反應。五、報告：大腸桿菌為_、枯草芽孢桿菌為_、金黃葡萄球菌為_實驗三 霉菌形態(tài)的觀察一、目的要求：1、學習觀察霉菌的方法。2、掌握幾種常用霉菌的形態(tài)特征。3、學會霉菌制片技術。4、了解霉菌的形態(tài)構造及菌落特征。二、基本原理：霉菌是具有分枝的菌絲體，菌絲體及孢子的形態(tài)是識別不同種類霉菌的重要依據(jù)。霉菌菌絲較粗大，一般在低倍鏡下即可觀察到，觀察霉菌常用的方法有：1、直接制片觀察法：將培養(yǎng)物置于乳酸石炭酸棉藍染色液中，制成霉菌制片鏡檢，用此染液制成的霉菌制片的特點是細胞不變形，具有防腐作用，不易干燥

7、，能保持較長時間，防止孢子飛散。必要時，可用樹膠封固，制成永久標本長期保存。2、載玻片培養(yǎng)觀察法：用無菌操作將培養(yǎng)基薄層置于載玻片上，接種欲觀察物，然后蓋上蓋玻片，霉菌即在載玻片和蓋玻片之間的有限空間內沿著玻片橫向生長，培養(yǎng)一定時間后，直接將載玻片放在顯微鏡下觀察，這種方法可以保持霉菌的自然生長狀態(tài)，這便于觀察不同發(fā)育期的培養(yǎng)物。5 / 29三、實驗材料：1、 菌種：根霉、毛霉、曲霉、青霉培養(yǎng)物。米曲霉、毛霉平皿菌落2、 以載玻片培養(yǎng)法制成的上述霉菌標本3、 乳酸石炭酸棉藍溶液4、 顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、吸水紙、鑷子四、實驗方法及步驟：1、曲霉形態(tài)的觀察 曲霉的營養(yǎng)菌絲體是由具有橫隔的分枝菌

8、絲構成，無色或有明亮的顏色。分生孢子梗是從足細胞生出，并略垂直于足細胞的長軸。分生孢子梗大都無橫膈，常在頂部膨大成為頂囊，頂囊表面產生小梗，放射生出，分生孢子自小梗頂端相繼形成，最后成為不可分枝的鏈。由頂囊小梗以及分生孢子鏈構成分生孢子穗，形如菊花，具有各種不同的顏色。 用肉眼觀察曲霉的斜面或平皿上的生長情況。 用低倍鏡觀察長于培養(yǎng)皿上的曲霉的分生孢子形狀。 制片（或用懸滴培養(yǎng)片）用針挑取菌落邊緣的嫩菌絲，小心放在載玻片上，觀察菌絲有無橫膈及分生孢子著生等細微結構。2、毛霉形態(tài)的觀察： 毛霉的菌絲體大多為單細胞，在培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內，能廣泛的蔓延，無假根和匍匐絲。菌絲體直接生出孢子梗，一般單生

9、，分枝或較少不分枝，分枝頂端都產生孢子囊梗，孢子囊球形，橢圓形。大多數(shù)種類子囊成熟后，其壁易消失或破裂，但留有殘跡，囊內部有囊軸。 用肉眼觀察毛霉在斜面或平皿中的生長情況。 將插片培養(yǎng)的血蓋片一面擦干凈另一面向上放在載玻片上在低倍鏡下觀察孢子囊大小形態(tài)、色澤、孢子囊梗的粗細。 將血蓋片翻過來壓在載玻片上，在高倍鏡下觀察毛霉的細微結構，觀察孢子囊梗、囊軸、孢子囊、孢子及厚垣孢子的形態(tài)。3、菌落形態(tài)的觀察：用肉眼或低倍鏡觀察霉菌形態(tài)。壓滴法觀察：取一大頭針挑出一完整菌體放于潔凈載玻片上，用高倍鏡觀察，并繪圖。實驗四 懸滴培養(yǎng)（曲霉菌孢子發(fā)芽率測定）一、目的要求：5 / 291、了解懸滴培養(yǎng)的概念。

10、2、掌握曲霉菌孢子發(fā)芽率的測定方法。二、基本原理：曲霉菌用于釀造發(fā)酵的菌株較多，主要利用它在生產繁殖過程中分泌的蛋白酶，淀粉酶等作用發(fā)酵原料中的蛋白質、淀粉等成分生成發(fā)酵產品的有效成分及中間成分。曲霉菌的繁殖方式主要是無性孢子繁殖。繁殖生長的過程：分生孢子遇到適宜的條件（溫度、水分、養(yǎng)分）即開始吸水，體積膨脹（約是原體積12倍）繼而開始發(fā)芽產生菌絲。菌絲生長到一定程度即會產生足細胞，足細胞上會產生分生孢子梗，在梗的頂端產生頂囊。頂囊又生出小梗，在小梗上會生出一串串的分生孢子，完成一個生長周期。曲霉菌孢子發(fā)芽率的測定是將成熟休眠的曲霉菌的分生孢子，接種到培養(yǎng)基上控制一定溫度（300C）培養(yǎng)45小

11、時，在顯微鏡下觀察發(fā)芽孢子和未發(fā)芽總孢子數(shù)的百分比。在發(fā)酵生產用菌的培養(yǎng)過程中具有很重要的意義。三、儀器材料： 顯微鏡、培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、凹玻片、培養(yǎng)基（米汁）、米曲霉種曲（固體粉末）、無菌稀釋液四、操作步驟：1、將培養(yǎng)基放在搪瓷缸的水浴中于電爐上加熱熔解（每四個小組做一份）。2、取米曲霉種少許（約達拇指蓋大?。┓湃胧⒂?0ml無菌水的三角瓶內（內有4-5粒玻璃珠）充分振蕩，使其孢子散成個體懸浮液。（全班做一份）。3、用吸管吸取1ml孢子懸浮液，放入盛有9ml無菌水的試管內，充分振蕩晃勻做10倍梯度稀釋。（每四個小組做一份） 4、取一片血蓋片擦干凈，另取一支1ml吸管，取一滴試管內的孢子稀釋液放

12、在血蓋片上，另取一只玻璃棒蘸取一滴加熱融化的培養(yǎng)基快速與血蓋片上的孢子稀釋液混合均勻，并使其涂布面積的直徑控制在10mm以內，在10秒內完成。 5、待血蓋片上的培養(yǎng)基涂布層冷卻凝固后，取一凹玻片，將血蓋片上的涂布層扣在凹玻片上的凹窩內。然后將凹玻片放在顯微鏡下用高倍鏡觀察。在每個視野內應有10個左右的孢子，若不符合要求應重新按第四條操作至符合要求。（每人做一份） 6、在培養(yǎng)皿內加入2ml左右的水，將制備好的培養(yǎng)基涂片放在培養(yǎng)皿內的小導管上，不要使涂片與水面接觸。（每組2個人的涂片放在一個培養(yǎng)皿內分別作好標記）蓋好蓋，放在300C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)45小時，取出放在顯微鏡下觀察一個視野內發(fā)芽孢子和未發(fā)

13、芽孢子數(shù)，查看34個視野，總數(shù)進行計算。7 / 29 7、計算： 發(fā)芽率%=34個視野發(fā)芽孢子總數(shù)/3-4個視野和未發(fā)芽孢子總數(shù)×100% （培養(yǎng)時間 h）五、注意事項： 1、用培養(yǎng)基涂片時一定要趁熱快速與菌液混合均勻涂布成光潔平整的培養(yǎng)層，否則會形成凹凸不平的培養(yǎng)面影響觀察。 2、培養(yǎng)基涂片層扣在凹窩上以后血蓋片千萬不能再在載玻片上移動，否則會造成培養(yǎng)基涂片層斷裂影響觀察。 3、鏡檢時一定選取有代表性的3-4個視野觀察技術，每個視野孢子數(shù)最多不能超過20個否則會出現(xiàn)漏計或重計。 4、發(fā)芽率的高低與培養(yǎng)時間有關，在計算發(fā)芽率時一定注明培養(yǎng)時間。IV 課后小結：1、這次實驗很成功，大多

14、數(shù)同學培養(yǎng)的出芽率都很正常。2、這次實驗從其幾個班的整體分析，培養(yǎng)時間是很關鍵的，4-5小時。近5小時最好。實驗五 酵母細胞計數(shù)測定一、實驗目的 了解血球計數(shù)板的構造、計數(shù)原理和計數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計數(shù)的技能。二、實驗原理 測定微生物細胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數(shù)法和平板計數(shù)法。 顯微計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數(shù)板，一般細菌則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計數(shù)板下部

15、的細菌不易看清。 血球計數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數(shù)區(qū)（圖21-1），計數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計數(shù)區(qū)分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數(shù)區(qū)分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)區(qū)是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數(shù)區(qū)都由400個小方格組成。7 / 29計數(shù)區(qū)邊長為1mm，則計數(shù)區(qū)的面積為l mm2，每個小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)區(qū)的

16、體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000mm3。使用血球計數(shù)板計數(shù)時，先要測定每個小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數(shù)量。已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3所以：1mm3體積應含有小方格數(shù)為1000mm3/1/4000mm3=4×106個小方格，即系數(shù)K=4×106 。因此：每ml菌懸液中含有細胞數(shù)= 每個小格中細胞平均數(shù)（N）×系數(shù)（K）×菌液稀釋倍數(shù)（d）三、實驗器材 1活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養(yǎng)液

17、。2器材：顯微鏡、血球計數(shù)板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數(shù)器、滴管、擦鏡紙。四、實驗方法 1菌懸液制備：稀釋10倍。2取潔凈的血球計數(shù)板一塊，在計數(shù)區(qū)上蓋上一塊蓋玻片。3將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數(shù)板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數(shù)區(qū)上，不要使計數(shù)區(qū)兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數(shù)區(qū)深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產生氣泡）。4靜置片刻，將血球計數(shù)板置載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉換高倍

18、鏡觀察并計數(shù)。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。5計數(shù)時若計數(shù)區(qū)是由16個大方格組成，按對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數(shù)。如果是25個大方格組成的計數(shù)區(qū)，除數(shù)上述四個大方格外，還需數(shù)中央l個大方格的菌數(shù)（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線，以減少誤差。6對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數(shù)23次（每次數(shù)值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數(shù)（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數(shù)量。8 / 297測數(shù)完

19、畢，取下蓋玻片，用水將血球計數(shù)板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內保存。五、實驗作業(yè)： 將實驗結果填入下表中：次 數(shù)12中方格左上格左下格右上格右下格中心格左上格左下格右上格右下格中心格細胞數(shù)每小格細胞平均數(shù)（N）系數(shù)（K）4×106菌液稀釋倍數(shù)10每ml菌懸液中所含細胞數(shù)平均值實驗六 酵母出芽率死亡率測定一、 目的要求：1、 進一步掌握血球計數(shù)板的應用。2、學會出芽率、死亡率的測定。二、 實驗材料及儀器：1、 菌液（分裝在燒杯中+小滴管）2、顯微鏡、血球計數(shù)板3、呂氏美蘭（甲基藍）三、 樣品稀釋：用10倍稀釋法達每小格內有45個

20、菌體為宜。四、 操作步驟：1、 制片：搖勻 滴加菌樣：多則吸去，少則滴加。2、 計數(shù)：對位于雙格線上的菌體若大部分在內格線上）（1） 采用只計兩邊法：計上不計下，計左不計右。（2） 芽體小于菌體12時為細胞芽體，大于菌體12時為細胞。（3） 計不同深度的細胞。3、 死亡率的測定：藍者為死細胞（代謝停止，無還原能力）無色為活細胞（還原能力強 藍色 無色）注意：（1）光線暗為好（2）聚光下降（3）位置對準（4）焦距很?。簭膫让婵磶缀蹰咧?，用細調絲下降載物臺。9 / 29五、實驗報告：酵母出芽率次數(shù)123出芽率中格序號123451234512345平均值細胞數(shù)芽體數(shù)細胞數(shù)ml芽體數(shù)ml出芽率酵母死亡

21、率123456平均值死亡率活細胞死細胞實驗七霉菌形態(tài)的觀察一、 目的要求：掌握工業(yè)生產中幾種常用霉菌的形態(tài)特征，學習觀察霉菌的方法。二、 實驗材料：1、平皿菌落2、顯微鏡、大頭針、載玻片等三、 實驗方法及步驟：1、 菌落形態(tài)的觀察：用肉眼或低倍鏡觀察霉菌形態(tài)。2、 壓滴法觀察：取一大頭針挑出一完整菌體放于潔凈載玻片上，用高倍鏡觀察，并繪圖。10 / 29實驗八、 培養(yǎng)基制備一、目的要求1、明確培養(yǎng)基的配制原理。2、通過對米曲汁培養(yǎng)基和細菌培養(yǎng)基的配制，掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟二、基本原理米曲汁培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是兩種應用最廣泛和最普通的霉菌及細菌培養(yǎng)基，米曲汁培養(yǎng)基為微生物生長提

22、供大量的碳源和能源等。細菌培養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白胨和NaCI。其中牛肉膏為微生物提供碳源和能源氮源，而NaCI提供無機鹽。在配制培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下960C時溶化，一般實際應用時在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在400C時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質量和氣溫的不同而有所不同。另外細菌培養(yǎng)基，要用稀酸或稀堿將其PH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長繁殖。三、器材大米，牛肉膏，蛋白胨，NaCI,瓊脂，；1mol/L NaOH, 1mol/L HCI；試管，三角燒瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養(yǎng)基分裝器，扭力天平牛角

23、匙，高壓滅菌鍋，鋁鍋、pH試紙（pH5.5-9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，紗布等。四、操作步驟1米曲汁培養(yǎng)基（8人一組，每人5支-6支）（1）大米300g淘洗干凈加入（1：4）的水2.5斤熬煮成米粒松散的粥（2）加入大米重量15%的麩曲40g攪拌均勻。（3）加入50單位/g的糖化酶約1g攪拌均勻。（4）放置于60-610C培養(yǎng)2-3h。（5）過濾不足時用蔗糖調整（濾液（7-7.5B0t）。（濾液波美度太高時加水調節(jié)：VH2O=B0e/7.5B0e，如果濾液波美度達不到所需值，應加熱濃縮。）（6）向濾液中加入2%瓊脂加熱熔解（米曲汁量）（7）分裝試管，塞棉塞、捆扎。（8）滅菌。（9）擺斜面。（

24、10）培養(yǎng)基檢驗: 500g×50單位/g÷ 5萬 =1.5g(大米重量) (糖化酶活力) 將培養(yǎng)基在300C的條件下培養(yǎng)2-3天，觀察是否染雜菌。11 / 292、細菌培養(yǎng)基制備：（2人一組，每人做5支，配制100ml）(1) 蛋白胨1g, 牛肉膏0.3g(3%的牛肉膏溶液10ml) NaCI 0.5g 瓊脂2g 水 100ml(注:牛肉膏事先配成3%溶液待用)(2) 用10%Na2CO3條pH至7.2-7.4(或用NaOH) (3) 加入瓊脂加熱攪拌溶解.(4) 分裝試管，塞棉塞、捆扎。(5) 滅菌。（6）擺斜面。(7)培養(yǎng)基檢驗:50ml水+蛋白胨1g+10ml牛肉膏

25、+0.5gNaCI+40ml水+2g瓊脂 3.淀粉瓊脂培養(yǎng)基(高氏1號培養(yǎng)基,培養(yǎng)放線菌) 可溶性淀粉 20g 2gKNO3 1g 0.1gK2HPO4 0.5g 0.05gNaCI 0.5g 0.05gMgSO4 0.5g 0.05gFeSO4 0.01g 0.001g瓊脂 20g 2g水 1000ml 100mlpH 7.2-7.4 7.2-7.4（注意：分五組，7人一組，每人4支）配制時，先用少量水，將淀粉調成糊狀，在火上加熱邊攪拌邊加水及其他成分，溶化后，補足水分至1000ml（或100ml）。1.05Kg/Cm2,121.30C滅菌20分鐘。五、實驗報告 六、總結：1這次實驗學生試管

26、培養(yǎng)基制備數(shù)：每人5-6支。其中：細菌2支，酵母菌2支，霉菌2支，淀粉培養(yǎng)基1支12 / 29用途：練習接種：細菌2支，酵母菌2支，霉菌1支，淀粉培養(yǎng)基1支?？荚嚕杭毦?支，酵母菌或霉菌1支。2 實驗注意事項：（1）配料要準確、嚴格。（2）瓊脂量指米霉菌汁（濾液）量的2%（不能過少）。（3）消毒壓力一定要達到0.1帕30min. (4) 等斜面涼透后再捆扎收藏備用. (5)檢驗pH的時間.實驗九微生物的接種一、 實驗目的要求：1、 掌握無菌操作的基本環(huán)節(jié)。2、在規(guī)定的時間內完成一定數(shù)量的接種任務。二、 實驗材料：1、 菌種：細菌：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌酵母菌：面包酵母霉菌：米曲霉、

27、黑曲霉2、 基質：細菌基質 糖液3、 接種工具：接種環(huán)、酒精燈、接種箱等4、 其它三、 實驗原理：接種中始終保持無菌操作，所用器具必須滅菌，接種前后接種針要滅菌，在火焰周圍接種，棉塞也要滅菌。四、 操作：1、 接種前準備：查接種工具，貼標簽：菌名、姓名、日期（代數(shù)）2、接種方法：（1）拿試管（2）點酒精燈（3）接種針滅菌（4）接種（5）試管口滅菌、棉塞滅菌（6）重塞棉塞（7）接種針滅菌3、注意事項：（1）勿劃破基質表面（2）菌體勿沾到管壁上（3）菌體勿燙死實驗十、空氣中微生物的檢驗一、目的要求1、通過實驗了解一定環(huán)境中微生物的分布狀況。2、學習并掌握空氣中微生物檢驗的基本方法。3、學會沉降平板

28、法測定空氣中微生物含量的方法。 13 / 29二、基本原理:空氣中含有多種微生物，當落到適宜的環(huán)境條件下如：營養(yǎng)、酸堿度、氧等，再在適宜的溫度條件下進行培養(yǎng)，就會良好生長。 三、實驗儀器 粗天平、 培養(yǎng)皿、 150ml三角瓶、 燒杯、 吸耳球、10ml吸管、 高壓滅菌鍋四、操作步驟（一）、平板配方（每組配70ml）蛋白胨1% 牛肉膏0.3% NaCl0.5% 瓊脂1.5% 葡萄糖0.1% PH7-7.2（二）、培養(yǎng)基配制、滅菌、制平板：1、配制：用100ml燒杯在天平上稱取牛肉膏0.2g,然后再用紙片分別稱取蛋白胨0.7g, NaCl 0.35g放入燒杯中，再吸取1%葡萄糖7ml，加入少量水（

29、約30ml）溶解后用1M NaOH調PH至7.0-7.2，然后倒入100ml量筒中加水至70ml用漏斗倒入150ml三角瓶中再加入1-1.5g瓊脂，塞入棉塞用紙包好滅菌。2、器皿準備：每組將直徑90mm的培養(yǎng)皿6個刷洗干凈分2包用紙包好待滅菌。每組分別將一支10ml吸管和一個吸耳球用紙包好待滅菌。 3、滅菌：將上述培養(yǎng)基和器皿放入高壓滅菌鍋內控制蒸汽壓力0.1MPa至0.12MPa滅菌15min，緩慢排氣冷卻。4、制平板：當滅菌器壓力回零后，打開蓋趁熱取出放入接種箱內，在無菌條件下，先將三角瓶內培養(yǎng)基晃勻趁熱用10ml吸管吸取10ml培養(yǎng)基放入培養(yǎng)皿內晃平后放入水平位置冷卻凝固。（三）、使空氣

30、中的微生物自然落入培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上，將冷卻凝固后的平板培養(yǎng)基包好帶入被檢測場所，將平皿（5個）均勻擺在被測場所的離地面高0.8m以上的平面上（防止將地面的塵土吸起落入皿內）14 / 29將平皿打開，估計空氣中菌的濃度多少，使平板培養(yǎng)基暴露在空氣中待一定時間（6-60min）然后將培養(yǎng)皿蓋好。培養(yǎng)1-2天。 該次安排各組被測場所及暴露時間如下：1-2組 檢測接種箱內空氣 60分鐘3-4組 檢測接種箱內空氣 30分鐘5-6組 微生物實驗室內空氣 5分鐘7-8組 教室內空氣 5分鐘9-10組 衛(wèi)生間空氣 5分鐘11-12組 實習廠空氣 1分鐘注意：（每組6個平板培養(yǎng)基，其中5個做實驗，1個做無菌空白

31、對照）（四）培養(yǎng)： 將培養(yǎng)皿包好倒扣在350C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3天觀察記錄平皿內的菌落數(shù)，取5個平皿的平均值計稱。（五）、計稱：1、 計稱5個平皿的平均菌落數(shù) 平皿平均數(shù)=（皿1+皿2+皿5）/52、計稱100cm2培養(yǎng)基暴露10分鐘時的菌落數(shù) 100cm2培養(yǎng)基10分鐘菌落數(shù)=平皿平均數(shù)/r2t×10×100 平皿平均數(shù)-5個平皿平均菌落數(shù) r-平皿半徑（cm） t-平皿培養(yǎng)基暴露在空氣中的時間（按分鐘計算） 10-按10分鐘計為單位15 / 29100-求100cm2培養(yǎng)基上的菌落數(shù)3、求1M3空氣中的活菌數(shù)每立方米空氣中活菌數(shù)=100cm2培養(yǎng)基上的菌落數(shù)/20×

32、;100020-100cm2培養(yǎng)基暴露10分鐘（在空氣中）相當于接受20升空氣中的活菌數(shù)。1000-將1升空氣中的活菌數(shù)按稱成1M3空氣的活菌數(shù)。實驗十一、 微生物的分離技術（分離產蛋白酶的米曲霉）一、目的要求學會在無菌操作下進行純種分離的操作方法。二、基本原理為了獲取某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長，而抑制其它菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。三、實驗儀器1、三角瓶250ml 1個2、試管 4個

33、3、1ml吸管5支4、培養(yǎng)皿4個5、10ml吸管 1支 6、吸耳球 1個7、代分離菌種少許8、分離培養(yǎng)基四、操作步驟1稀釋分離前的準備工作：將三角瓶、試管、吸管、培養(yǎng)皿用水刷洗干凈。在三角瓶中裝入50ml蒸餾水，放入5-6粒玻璃珠用棉塞塞好，用牛皮紙包扎。每支試管裝入ml蒸餾水用棉塞塞好編號后用牛皮紙捆扎在一起。將培養(yǎng)皿用紙包在一起。有吸管的上端塞入長2cm左右的棉花、棉塞不得外露也不得過松過緊，分別用紙條包好。吸耳球用紙包好。將上述物品放入高壓消毒器內，壓力0.1MPa滅菌20分鐘后取出放入接種箱內冷卻備用。將分離培養(yǎng)基放入搪瓷缸中倒入少量水放在電爐上加熱煮沸至培養(yǎng)基全部熔解為止，連同搪瓷缸

34、取下備用。 17 / 292菌樣的稀釋分離：取被分離的菌樣約0.005克左右（三角瓶菌種象大米粒2-3塊）放入冷卻后的三角瓶內的水中塞好棉塞后用力振搖5分鐘以上使菌種孢子個個分離后放入接種箱內。用75%乙醇棉球對手進行消毒后再在接種箱內對試管外表面進行消毒。在接種箱內，按無菌操作要求用1ml吸管吸取三角瓶內菌液1ml放入1號試管內塞好棉塞后晃勻，并將用過的吸管放在1號試管中，依次類推做至4號試管。此時菌樣已稀釋50萬倍，要求在三號或4號試管內每ml稀釋液中含孢子在5-15個之間為宜。分別從3號、4號試管中吸取1ml稀釋液放入2個培養(yǎng)皿中。將煮沸熔解后的培養(yǎng)基冷卻至450C左右（不能用溫度計以感

35、覺不燙手為宜）用75%乙醇棉球消毒后在接種箱內用10ml吸管吸取 15ml培養(yǎng)基放在4個培養(yǎng)皿內，每放完一個培養(yǎng)皿后迅速用手晃動平皿，使培養(yǎng)基在位未凝固前與菌液混合均勻。然后放在水平面臺上待凝固后取出用紙包好扣于300C培養(yǎng)箱內培養(yǎng)2-3天觀察結果。 五、注意事項： 1、被分離菌種的使用量一定要控制正確，要求三角瓶中每ml稀釋液中含孢子數(shù)在5-10萬個為宜，大于此數(shù)會導致分離失敗。 2、向平皿中加入的培養(yǎng)基一定將溫度控制在45-500C之間，而且要求加入時要迅速否則會引起凝固，無法吸取或培養(yǎng)基在平皿內提前凝固與稀釋菌液混合不勻，凝固面不平的現(xiàn)象。 3、皿內培養(yǎng)基在凝固時一定放在水平面上，否則會

36、造成培養(yǎng)基厚薄不均影響分離結果。 4、平皿一定要倒置放在培養(yǎng)箱內培養(yǎng)可防止雜菌和冷凝水進入。 17 / 29 六、實驗報告：分離培養(yǎng)基配制附后分離培養(yǎng)基制備：1、 配方： 酪蛋白0.4% KH2PO4 0.04% MgSO4 0.01% 瓊脂 2% PH自然2、 操作：（每小組配100ml，分裝6支試管，每支15ml）按上述配方稱取酪蛋白0.4g放入100ml燒杯中加入0.1MNaOH溶液5ml放在電爐上小火加熱熔解后，加入10ml0.4%KH2PO4（相當于干劑0.028g），10ml0.1%MgSO4(相當于干劑0.007g)混勻后加入75ml蒸餾水再加入2g瓊脂加熱攪拌溶解。分裝試管，加

37、棉塞滅菌。 （KH2PO4 , MgSO4 事先配成0.4%，0.1% 溶液） 實驗十二、 大腸菌群的測定一、 實驗 目的 ：1、了解大腸菌群在食品衛(wèi)生檢驗中的意義   2、學習并掌握大腸菌群的檢驗方法  二、實驗 原理： 大腸菌群系指一群能發(fā)酵乳糖，產酸產氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。 食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或ml）檢樣內大腸菌群最近似（the m

38、ost probable number-簡稱MPN）表示。三、 材料 3.1 樣品 :乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調味品或其他食品。 3.2 菌種 :大腸埃希氏菌（Escherichia coli） 產氣腸桿菌（Enterobacteria aerogenes） 3.3 培養(yǎng)基及試劑 :單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液。 3.4 其它 :恒溫箱、 藥物天平、培養(yǎng)皿、載玻片等 四、流程：大腸菌群檢驗程序如： 18 / 29 檢樣 稀釋 乳糖膽

39、鹽發(fā)酵管 36 ±1 ,24±2h 不產氣 產氣 大腸菌群陰性 伊紅美藍瓊脂平板 36 ±1 ,1824 h 報告 革蘭氏染色 乳糖發(fā)酵管 36 ±1 ,24±2h 19 / 29 革蘭氏陽性革蘭氏陰性 產氣 不產氣 無芽胞桿菌 大腸菌群陰性 大腸菌群陽性大腸菌群陰性 報 告 報 告 報 告 五、 操作步驟：1、 檢樣稀釋1.1 以無菌操作將檢樣25mL(或g)放于有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經(jīng)充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8 000-10 000

40、 r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。1.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。1.3 另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。1.4 根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。2、 乳糖發(fā)酵試驗:將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1 溫箱內,培養(yǎng)24±2

41、h,如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產氣者,則按下列程序進行。21 / 293、 分離培養(yǎng): 將產氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1 溫箱內,培養(yǎng)18-24h,然后取出,觀察菌落形態(tài),并做革蘭氏染色和證實試驗。4 、證實試驗:在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發(fā)酵管,置 36±1溫箱內培養(yǎng)24±2h,觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。5 、 報告: 根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù),查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。6、

42、 糞大腸菌群(faecal coliform)6.1 用接種環(huán)將所有產氣的乳糖膽鹽發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于EC肉湯管內,置44.5±0.2水浴箱內(水浴箱內的水面應高于EC肉湯液面),培養(yǎng)24±2h,經(jīng)培養(yǎng)后,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種于伊紅美藍瓊脂平板上,置 培養(yǎng)18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。6.2 結果報告: 根據(jù)證實為糞大腸菌群的陽性管數(shù),查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。實驗十三、 食品中細菌總數(shù)的測定 一、實驗目的： 1、 學習并掌握細

43、菌的分離和活菌計數(shù)的基本方法和原理。 2 、了解菌落總數(shù)測定在對被樣品進行衛(wèi)生學評價中的意義。 二、實驗原理： 菌落總數(shù)是指食品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落總數(shù)。菌落總數(shù)主要作為判別食品被污染程度的標志，也可以應用這一方法觀察細菌在食品中繁殖的動態(tài)，以便對被檢樣品進行衛(wèi)生學評價時提供依據(jù)。 菌落總數(shù)并不表示樣品中實際存在的所有細菌總數(shù)，菌落總數(shù)并不能區(qū)分其中細菌的種類，所以有時被稱為雜菌數(shù)，需氧菌數(shù)等。 三、實驗 材料： 3.1 食品檢樣 3.2 培養(yǎng)基21 / 29 :營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，無菌生理鹽水 3.3 

44、其它 ;無菌培養(yǎng)皿，無菌移液管，無菌不銹鋼勺。 四、 流程：檢樣 做成幾個適當倍數(shù)的稀釋液 選擇23個適當倍數(shù)的稀釋液各以1ml分別加入滅菌平皿內每皿內加入適量營養(yǎng)瓊脂 菌落計數(shù)報告五、操作 步驟： 1、 取樣、稀釋和培養(yǎng) 1.1 以無菌操作取檢樣25g（或ml），放于225mL滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經(jīng)充分振要或研磨制成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好置滅菌均質器中以800010000r/min的速度處理1min，制成1:10的均勻稀釋液。 1.2 用1ml滅菌吸管吸取1:10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混合均勻，制成1:100的稀釋液。 1.3 另取1ml滅菌吸管，按上項操作順序，制10倍遞增稀釋液，如此每遞增稀釋一次即換用1支10ml吸管。 1.4 根據(jù)標準要求或對