甾體藥物化學(xué)的新進(jìn)展_甾體轉(zhuǎn)化酶及其抑制劑的研究近況

1、綜述與專論甾體藥物化學(xué)的新進(jìn)展甾體轉(zhuǎn)化酶及其抑制劑的研究近況譚載友廖清江(廣東藥學(xué)院藥物研究所廣州510224)摘要在分子水平研究的基礎(chǔ)上討論了3-氧-5-烯甾體異構(gòu)酶與芳構(gòu)化酶的活性部位及作用機(jī)制,并介紹了甾體轉(zhuǎn)化酶抑制劑的開發(fā)和甾體芳構(gòu)化酶抑制劑的研究進(jìn)展。關(guān)鍵詞甾體轉(zhuǎn)化酶甾體轉(zhuǎn)化酶抑制劑芳構(gòu)化酶甾體芳構(gòu)化酶抑制劑當(dāng)人們研究和認(rèn)識了疾病的生化變化因果關(guān)系以后,便以酶為研究對象來研制新藥。已有很多藥物是和酶相互作用后起效的:通過抑制或促進(jìn)酶的活性,恢復(fù)被紊亂了的調(diào)節(jié)機(jī)制或受到干擾的正常生化變化過程。近代生命科學(xué)的發(fā)展已經(jīng)闡明了一些酶的三維結(jié)構(gòu);分子生物學(xué)研究亦揭示了大量酶促反應(yīng)的過程和細(xì)節(jié),

2、從而提供了新藥作用的靶向。并據(jù)此設(shè)計出新的酶抑制劑。下面分述甾體轉(zhuǎn)化酶的研究進(jìn)展以及與甾體相關(guān)的酶抑制劑的研究開發(fā)現(xiàn)狀。1甾體轉(zhuǎn)化酶1.13-氧-5烯甾體異構(gòu)酶3-氧-5-烯甾體異構(gòu)酶可以使3-氧-5-烯甾體或3-氧-5(10)烯甾體轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的不飽和酮,顯示顯著有效的催化作用。這種酶能結(jié)晶,催化反應(yīng)很容易進(jìn)行,不需要輔助因子,因此它對甾體化學(xué)、酶甾體反應(yīng)機(jī)制和動力學(xué)的研究非常有利。這種異構(gòu)酶具有可分辨的直徑小的亞基,分子量13.394KD。它具有兩個均相動力學(xué)甾體鍵合區(qū)域,每一個前體由125個氨基酸組成。應(yīng)用氘標(biāo)記底物的方法證明,某些甾體異構(gòu)化反應(yīng)的主要途徑是4 -氫通過二烯醇分子內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?

3、 位置,此質(zhì)子的轉(zhuǎn)移是通過異構(gòu)酶來實(shí)現(xiàn)的。1.2活性部位的定位當(dāng)競爭性抑制劑 , -不飽和甾體酮(I)存在時,光( >300nm)可使酶不可逆失活。已經(jīng)證明這種失活反應(yīng)發(fā)生在酶的活性位置。為了分辨光反應(yīng)位置,Hearne和Benisek通過睪酮和半胱氨酸配對,以乙二胺作隔間,連接O-(羥甲基)瓊脂糖顆粒,制備成固態(tài)光親和劑()。將異構(gòu)酶放入光試劑小柱,應(yīng)用光輻射產(chǎn)生酶-試劑復(fù)合體。不和共價鍵結(jié)合的酶可以從柱中洗脫。根據(jù)二酰-甾體酯鍵的低堿性水解的數(shù)據(jù),證明了天冬氨酸38是共價配置點(diǎn)和活性部位。用堿基機(jī)制抑制劑()可輔助分辨出活性部位的另一種氨基酸。它可以和天冬氨酰57的酰胺基反應(yīng),形成一

4、種不穩(wěn)定的烯式復(fù)合體結(jié)構(gòu),酶正是通過這種方式固定化,從而使甾體發(fā)生異構(gòu)反應(yīng)。321藥學(xué)進(jìn)展1998年22卷第1期2Pollack等4制備并評價了3 和3 -環(huán)也是通過天冬氨酸38與酶鍵合的。這一結(jié)果唯一的解釋為17 -環(huán)氧基甾體是以可逆鍵合模式與酶反應(yīng)的7。Bevins等8應(yīng)用掃描紫外吸收光譜,證明()可以兩種不同的方式與酶鍵合。這說明活性部位似乎并無嚴(yán)格的甾體化學(xué)要求。氧基甾體()和()作為直接作用活性部位的抑制劑。是異構(gòu)酶可逆抑制劑,而是不可逆抑制劑。已證實(shí)兩種甾體化合物是以 -面與酶的天冬氨酸38結(jié)合。17 -環(huán)氧基甾體馬萘雌酮衍生物()是另一種直接和活性部位作用的抑制劑6。它51.3分

5、子模型研究順磁標(biāo)記雄(甾)烷()是另一個有效的異構(gòu)酶競爭性抑制劑。Kuliopulos等9用順磁(ESR)、核磁共振(NMR)檢測結(jié)合分辨率為2.5 的X-射線結(jié)構(gòu)測定和計算機(jī)圖形學(xué),論是順磁甾體和普通底物是不同的,可以肯定這種酶適應(yīng)不同的甾體。模型實(shí)驗(yàn)表明,酪氨酸55酚基可能供給質(zhì)子或氫,鍵合到甾體的3-氧代基上。酪氨酸14緊靠結(jié)合的甾體,方位不固定。,丙氨酸取代酪氨酸55時,這種酶和原型酶活性差別較小,而用天冬酰胺取代天冬氨酸38得到的酶就比原型酶的轉(zhuǎn)化速率低10。用苯丙氨酸取代酪氨酸14后的酶的折疊速率比原型酶低104.7。這也說明,酪氨酸14是該酶催化作用的基本成分。1.4作用機(jī)制11

6、5-烯甾體異構(gòu)酶Xue等證明3-氧代-使甾體上的4 -氫轉(zhuǎn)變到6 -氫的烯醇化過程是異構(gòu)化的限速步驟。通過對酪氨酸14和天冬氨酸38的突變研究已經(jīng)證明:此處酪氨酸14擔(dān)當(dāng)了酸的角色,而天冬氨酸38擔(dān)當(dāng)了堿的角色1。5.6倍,現(xiàn)已用于普通高膽固醇患者。而具有更大側(cè)鏈的化合物(IX)是裂解膽固醇側(cè)鏈酶細(xì)胞色素P-450scc的抑制劑。2甾體轉(zhuǎn)化酶抑制劑高效和高選擇性的轉(zhuǎn)化酶抑制劑現(xiàn)已成為研究開發(fā)甾體新藥的熱點(diǎn)課題,這些抑制劑有希望成為甾體抗激素。為了說明這一研究領(lǐng)域的技術(shù)發(fā)展和問題,以下將討論裂解膽固醇側(cè)鏈酶的抑制劑和使雄烯二酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇品油姆紭?gòu)化酶的抑制劑。2.1細(xì)胞色素P-450scc的作用膽

7、固醇的側(cè)鏈被裂解轉(zhuǎn)變?yōu)樵戌尴┐纪倪^程,發(fā)生于產(chǎn)生甾體的線粒體組織。首先是引入一個(22R)-羥基,接著又在20R位置二次羥基化,最后再氧化產(chǎn)生孕甾烯醇酮和4-甲基戊醛13。這三步均由細(xì)胞色素P-450scc催化。這一過程用到3個O2,所需電子由NADPH通過腎上腺皮質(zhì)鐵氧化還原蛋白還原酶和皮質(zhì)鐵氧蛋白提供給細(xì)胞色素P450scc。在催化過程中,血紅素鐵原子處于關(guān)鍵位置。甾體的氫原子插入酶里,位于血紅素鐵的鄰位。從電子自旋回聲光譜發(fā)現(xiàn),膽固醇衍生物的氘與血紅素鐵之間的距離大約是4 。細(xì)胞色素P-450scc的底物特異性不高。側(cè)鏈為5到10個碳原子的膽固醇同系物均12由此可見,認(rèn)識甾體對受體的鍵

8、合和甾體對酶的鍵合之間的基本差別非常重要。當(dāng)和受體結(jié)合時,甾體被周圍蛋白質(zhì)緊密束縛,若僅有小小的結(jié)構(gòu)變化不會減小親和力,大的取代結(jié)構(gòu)例如酚基或叔丁基才會影響活性。另一方面,如果要開發(fā)酶的抑制劑,使用大的取代基可以獲得較適宜的鍵合態(tài)和較高的選擇性。這可從最近開發(fā)的3-羥基-3-甲戊二酰基輔酶A還原酶抑制劑的實(shí)例中得到證實(shí)。(3R)-甲瓦龍酸()可與該酶結(jié)合,使可轉(zhuǎn)變?yōu)樵戌薮纪?。這種酶催化允許底物A環(huán)上結(jié)構(gòu)變化。3-酮基衍生物是配位性較低的底物,而(22R-)羥基衍生物亦能有效地轉(zhuǎn)變?yōu)樵戌尴┐纪?。與此相似的是其硫酸酯可轉(zhuǎn)變?yōu)樵戌尴┐纪蛩狨?它是比膽固醇更好的底物15。象許多甾體轉(zhuǎn)化酶一樣,細(xì)胞色

9、素P-450scc是一種多功能酶。Mochizuki等報道,牛細(xì)胞色素P-450scc對脫氧皮質(zhì)(甾)酮1614藥學(xué)進(jìn)展1998年22卷第1期4依賴于取代基。甾體可用碳原子20和22或碳原子6鍵合到酶的血紅素鐵的鄰近。開發(fā)細(xì)胞色素P-450scc抑制劑有兩條途徑。第一條途徑基于不可逆抑制劑堿基機(jī)制。Nagahisa和Orme-Johnson開發(fā)了硅基衍生物(),它通過 -羥基烷基硅烷衍生物()作為中間體反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)樵?甾)烯醇酮。這一中間體可與酶反應(yīng)點(diǎn)上的親核基團(tuán)反應(yīng)并減除酶的活性。已發(fā)現(xiàn)每6分子三甲基硅烷基衍生物羥基化,就有一分子酶失活,失活機(jī)制至今還未完全闡明。用親核試劑反應(yīng)將生成甾烯體()

10、。Nagahisa等還開發(fā)了炔基衍生物(),這類衍生物能形成反應(yīng)性環(huán)氧乙烯衍生物從而使酶失活。作為抑制劑,它的效力較衍17生物()小18。Otakanmi等19合成的衍生物()則是一種更有效力的不可逆抑制劑。第二種途徑是通過觀察血紅素鐵配位基團(tuán)穩(wěn)定性來考察其對催化過程的影響及相互20關(guān)系。)。其Sheets等開發(fā)了氨基甾體(氨基能與血紅素鐵配合,是細(xì)胞色素P-450scc有效力的競爭性抑制劑。()的側(cè)鏈?zhǔn)侨嵝缘?這或許可以解釋為什么這一化合物既是甾體17 -羥化酶(細(xì)胞色素P-45017 )競爭性抑制劑21等23還報道這個化合物也是兔肝細(xì)胞色素P-450111c的競爭性抑制劑。細(xì)胞色素P-45

11、0scc可以在黃體酮衍生物的6 位催化羥基化,而()對黃體酮羥基化有抑制作用。這證明,甾體與這些細(xì)胞色素結(jié)合的途徑很多。同時也表明,開發(fā)真正的選擇性抑制劑可能很困難。但有關(guān)的研究工作仍在進(jìn)行,如Nagahisa等24開發(fā)了競爭性抑制劑(),希望其較長的側(cè)鏈能夠提,又是肝微粒體細(xì)胞色素P-450(命名為黃體酮21-羥)抑劑22成的芳構(gòu)化酶就能治療依賴雌二醇的腫瘤。2.2芳構(gòu)化酶及其抑制劑芳構(gòu)化酶能使雄烯二酮成為雌酚酮,或使睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫?它也是一種細(xì)胞色素P-450酶(細(xì)胞色素P-450arom,細(xì)胞色素P-450xix)。它的氨基酸序列已經(jīng)測定,與其它細(xì)胞色素P-450的整體同源性僅約為20

12、%25,該酶催化雄烯二酮轉(zhuǎn)化為雌酚酮分這些研究只具有方法學(xué)意義,因?yàn)閷υ缙谏锖铣刹襟E的抑制,會影響到所有甾體激素的水平。如能對生物合成最后步驟具有抑制作用,才有治療意義。比如抑制雌二醇合三步進(jìn)行,第一步是C-19處羥基化成為19-羥基衍生物;第二步C-19處形成醛;第三步機(jī)制有幾種解釋26,最可能的假設(shè)是3-酮基優(yōu)先將C-1位氫移出并烯醇化后,再完成異構(gòu)化(見下圖)。現(xiàn)在已研究出一些開發(fā)該酶抑制劑的方法,合成了底物的類似物并試著尋找競爭性抑制劑。例如10-乙基同系物(),2,2-二甲基衍生物()26,7 -取代甾體(27)和3-亞甲基類似物()。這些酶的抑制劑對酶的親合力是天然底物雄烯二酮的

13、310倍。2829此外,根據(jù)酶的作用機(jī)制開發(fā)了幾組芳構(gòu)化酶抑制劑。如炔丙基類似物(),其可轉(zhuǎn)化為環(huán)氧乙烯物(),然后與酶反應(yīng),生成在體內(nèi)有活性的化合物。同時它也對其它細(xì)胞色素P-450有抑制作用32。二氟甲基類似物()可以轉(zhuǎn)變?yōu)榕c30,31藥學(xué)進(jìn)展1998年22卷第1期6酶反應(yīng)的氟?；?)。這些抑制劑作用于芳構(gòu)化過程的第一步,而通過反應(yīng)的最后步驟可以激活甾體的1,2-雙鍵。334-氨基甾體Minamestane。這些甾體化合物正在臨床試驗(yàn),也許有些將會在近年進(jìn)入市場。但臨床研究結(jié)果表明,所需的維持劑量偏高。由于這個原因,人們正從非甾體中研究開發(fā)芳構(gòu)化酶抑制劑。結(jié)論上面討論的例子說明,甾體化學(xué)

14、正在迅速發(fā)展,人們對甾體轉(zhuǎn)化酶的作用機(jī)制和結(jié)構(gòu)的認(rèn)識已較為深刻,但仍存在著許多不很清楚的問題。按照這一領(lǐng)域的發(fā)展趨勢,目前粗糙的模型將會被改善或被全新的模型所取代。工作的深入將會影響藥物的研究開發(fā)。因?yàn)殓摅w激素生物合成的關(guān)鍵酶不是像預(yù)想那樣具有專一性,于是提出了一個重要問題,即過去習(xí)慣上已確定的甾體合成途徑的許多實(shí)驗(yàn)是否還有效,現(xiàn)有的定理是否需要進(jìn)一步修正。由于已發(fā)現(xiàn)了許多有效的非甾的甾體基因酶抑制劑,那么,非甾體是否也具有孕激素和雄激素的活性?這給甾體化學(xué)帶來了研究、發(fā)明與創(chuàng)制新藥的極好契機(jī)。參考文獻(xiàn)1OgezJR,TivolWF,BenisedWF.Anovelchemi-3-ketost

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17、高劑量(30或150mg/(kgd)這種抑制劑后,腫瘤顯著減小34。4-羥基雄烯二酮Formastane()是一個不可逆抑制劑,當(dāng)注射劑量為250mg/2wk500mg/wk(i.m)時可降低血漿雌激素水平。該藥由Ciba-Geigy公司于1993年在英國首次上市,商品名Lentaron。適用于治療絕經(jīng)期婦女的乳腺癌,并且對經(jīng)激素治療后又復(fù)發(fā)的患者也有效35。此外,正在研究開發(fā)中的甾體芳構(gòu)化酶和甾體藥物化學(xué)的新進(jìn)展site-directedirreversibleinhibitorofdelta5-3-ketosteroidisomerase.BiochemBiophysResCommun,1

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