某些特殊生理生化試驗(yàn)

1、細(xì)菌鑒定中的某些特殊生理生化試驗(yàn)(一)糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn)細(xì)菌發(fā)酵葡萄糖、乳糖醇、糖苷等后，能產(chǎn)生各種有機(jī)酸（乙酸、丙酸、乳酸等）及各種氣體如H2、CO2等，當(dāng)然不同種細(xì)菌所產(chǎn)生的有機(jī)酸與氣體類(lèi)型是不一樣的。酸的產(chǎn)生可用指示劑來(lái)指示。在配制糖發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先加入了溴甲酚紫（PH6.8以上時(shí)呈紫色，PH5.2以下時(shí)呈黃色）。當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵糖而產(chǎn)生酸時(shí)，會(huì)使培養(yǎng)液由原來(lái)的紫色變?yōu)辄S色。氣體的產(chǎn)生可用糖發(fā)酵管中倒立的杜漢氏小管充滿氣體而加以證明。凡產(chǎn)酸、產(chǎn)氣用“”表示，只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣用“”表示，不產(chǎn)氣用“”表示。(二)M·R試驗(yàn)（甲基紅試驗(yàn)）某些細(xì)菌在糖代謝過(guò)程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸再被分

2、解為甲酸、乙酸、乳酸等。酸的產(chǎn)生可由加入甲基紅指示劑的變色而指示，有效PH范圍為4.26.3，細(xì)菌分解葡萄糖產(chǎn)酸，則培養(yǎng)液由原來(lái)的橘黃色變?yōu)榧t色，此為M·R正反應(yīng)，用“”表示。(三)V·P試驗(yàn)（乙酰甲基甲醇試驗(yàn)）某些細(xì)菌在糖代謝的過(guò)程中，分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸脫羧后，生成活性乙醛，后者再同丙酮酸或乙醛化合產(chǎn)生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰,二乙酰與蛋白胨中的精氨酸的胍基起作用，生成紅色化合物，此即為V·P正反應(yīng)，用“”表示。當(dāng)在試管中加入萘酚時(shí)，可以促進(jìn)反應(yīng)的出現(xiàn)。加入40%氫氧化鉀和等量5%萘酚試劑1220滴,振蕩

3、,37保溫2030分鐘。(四)硝酸鹽還原試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，氨和氮等。如果細(xì)菌能把培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，當(dāng)培養(yǎng)基中加入亞硝酸試劑時(shí)，則溶液呈現(xiàn)粉紅色或紅色。此時(shí)即為硝酸鹽還原試驗(yàn)陽(yáng)性反應(yīng)，為正反應(yīng)，用“”表示。陰性反應(yīng)的原因有兩種可能：1)細(xì)菌不能還原硝酸鹽，則培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中仍有硝酸鹽存在。2)亞硝酸鹽繼續(xù)分解生產(chǎn)氨和氮，則培養(yǎng)液中不應(yīng)該有硝酸鹽存在。以上兩種情況究竟屬于哪一種，可用鋅粉加以證明，如有硝酸鹽存在，當(dāng)向溶液加入鋅粉后（鋅是還原劑，將5價(jià)N變?yōu)?價(jià)N即把硝酸鹽還原為亞硝酸鹽）再加亞硝酸試劑，如溶液呈紅色，說(shuō)明硝酸鹽未被利用，為負(fù)反應(yīng)；相反地，

4、硝酸鹽不存在，則不呈紅色，說(shuō)明硝酸鹽已被還原，為正反應(yīng)。(五)吲哚試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能夠分解培養(yǎng)基內(nèi)蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生吲哚。吲哚與對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰吲哚，此為紅色物質(zhì)。即為正反應(yīng)，用“”表示。結(jié)果觀察：在培養(yǎng)液中加入乙醚約1ml左右（使呈明顯的乙醚層）充分振蕩使吲哚溶于乙醚中，靜止片刻，使乙醚層浮于培養(yǎng)基的上面，這時(shí)沿管壁慢慢加入吲哚試劑約10滴，如吲哚存在，則乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色（加入試劑后不可搖動(dòng)，否則被混合，紅色不明顯）。(六)H2S產(chǎn)生試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌能分解培養(yǎng)基中的含硫氨基酸（如甲硫氨酸及胱氨酸）生成H2S，如在配培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先加入檸檬酸鐵氨，則二者化合產(chǎn)生黑褐色的硫化鐵沉淀，

5、即為正反應(yīng)，用“”表示。(七)明膠液化試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌分泌蛋白酶（胞外酶），能分解明膠（動(dòng)物蛋白）產(chǎn)生小分子物質(zhì)。如果細(xì)菌具有分解明膠的能力，則培養(yǎng)后的培養(yǎng)基可由原來(lái)的固體形狀變?yōu)橐夯螤?，即為正反?yīng)，用“”表示。(八)淀粉水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生能水解培養(yǎng)基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），它能使淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不變藍(lán)色，如果在菌體周?chē)霈F(xiàn)無(wú)色透明圈，說(shuō)明淀粉被水解，即為正反應(yīng)，用“”表示。透明圈的大小說(shuō)明水解淀粉能力的大小。(九)油脂水解試驗(yàn)?zāi)承┘?xì)菌可以產(chǎn)生脂肪酶（胞外酶），它能分解培養(yǎng)基中的脂肪成為甘油及脂肪酸，這是促使含油多的食物變壞的原因之一。油脂被分解的檢驗(yàn)可通過(guò)在配

6、制油脂培養(yǎng)基時(shí)，預(yù)先加入中性紅指示劑（在中性時(shí)呈黃色，而在酸性時(shí)呈紅色），當(dāng)細(xì)菌分解脂肪產(chǎn)生脂肪酸時(shí)，則培養(yǎng)基中出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，即為正反應(yīng)，用“”表示。(十)石蕊牛乳試驗(yàn)牛乳中通常含有蔗糖，乳糖，蛋白質(zhì)（酪素）等成分，細(xì)菌對(duì)牛乳的利用主要是指對(duì)乳糖及對(duì)酪蛋白的分解利用。牛乳中常加入石蕊作為酸堿指示劑（在中性時(shí)呈淡紫色，在酸性時(shí)呈紅色，在堿性時(shí)呈藍(lán)色）。細(xì)菌對(duì)牛乳的利用分為三種情況：(1)酸凝固作用 細(xì)菌發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生許多酸，使石蕊牛乳變紅，同時(shí)當(dāng)酸度很高時(shí)，可使牛乳凝固，此稱“酸凝固”（牛乳凝固，紅色）(2)凝乳酶凝固作用 某些細(xì)菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，這種凝固作用在中性環(huán)境中發(fā)生

7、，通常這類(lèi)細(xì)菌還具有水解蛋白的能力，產(chǎn)生一些堿性物質(zhì)，使石蕊變藍(lán)（牛乳被凝固，紫或藍(lán)色）(3)胨化作用 酪蛋白被水解，使牛乳變的清亮透明，胨化作用可以在酸性或堿性條件下進(jìn)行，有時(shí)石蕊色素被還原脫色（蛋白酶越多，胨化現(xiàn)象越顯著，這是過(guò)去選擇蛋白酶菌方法之一），有時(shí)呈紅色或藍(lán)色（牛乳變清，紅色或藍(lán)色或無(wú)色）。（十一）檸檬酸鹽利用試驗(yàn)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)，須從生活環(huán)境中取得氮及碳元素作為營(yíng)養(yǎng)。在此培養(yǎng)基中僅有無(wú)機(jī)鹽及唯一的有機(jī)鹽即檸檬酸鹽作為營(yíng)養(yǎng)，氮源可由磷酸銨提供，而碳源只能來(lái)源于檸檬酸鈉，如果細(xì)菌不能分解檸檬酸鹽，就不能得到碳素營(yíng)養(yǎng)，因此就不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。大腸桿菌，痢疾桿菌等都不能分解檸檬酸鹽

8、，因此，在這種培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。但產(chǎn)氣桿菌能利用，故可生長(zhǎng)，細(xì)菌在分解檸檬酸鹽及磷酸銨后能產(chǎn)生堿性化合物，以致培養(yǎng)基由綠色變成深藍(lán)色，溴百里酚藍(lán)的指示范圍：PH6.07.6由綠變藍(lán)。實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基配制法：(1)葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨 10克 葡萄糖（乳糖）10克 NaCl 5克 蒸餾水 1000ml PH 7.4 1.6溴甲酚紫水溶液2ml配制時(shí)，按比例稱取蛋白胨、NaCl、糖，加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)PH值到7.47.6，加入溴甲酚紫溶液（1.6水溶液）至呈紫色為止。分裝試管，試管內(nèi)倒置一杜氏小管，然后塞上棉塞，11530分鐘滅菌。(2)M·R與V·P試管培養(yǎng)基：蛋白胨

9、5克 葡萄糖 5克 磷酸氫二鉀 5克 蒸餾水 1000mL pH自然 11520分鐘滅菌按需要量，稱取藥品，分裝試管，滅菌。(3)淀粉培養(yǎng)基：蛋白胨 5克 NaCl 5克 牛肉膏 3克 可溶性淀粉 2克 瓊脂 15克 蒸餾水 1000mL pH 7.2配制時(shí)，先用少量蒸餾水把淀粉調(diào)成糊狀，加入到液化好的培養(yǎng)基中，按比例加入瓊脂并加熱融化，分裝三角瓶，12130分鐘滅菌。(4)油脂培養(yǎng)基：蛋白胨 10克 牛肉膏 5克 NaCl 5克 香油或花生油 10克 中性紅（1.6%水溶液）約1mL 瓊脂1520克 蒸餾水 1000mL pH 7.2 12130分鐘滅菌配制時(shí)注意事項(xiàng)：1)不能使用變質(zhì)的油。

10、 2)油和瓊脂及水先加熱。3)調(diào)好PH之后，再加中性紅，使培養(yǎng)基稍呈紅色為止。4)分裝培養(yǎng)基，需要不斷的攪拌，使油脂均勻分布于培養(yǎng)基中。(5)明膠培養(yǎng)基：牛肉膏 3克 蛋白胨 10克 NaCl 5克 明膠 150克 蒸餾水 1000mL pH 7.07.2 11515分鐘滅菌。(6)硝酸鹽還原培養(yǎng)基蛋白胨 10克 NaNO3 5克 蒸餾水 1000mL pH 7.6 12130分鐘滅菌。(7)產(chǎn)生硫化氫試驗(yàn)的培養(yǎng)基蛋白胨20克 NaCl 5克 檸檬酸鐵銨0.5克 硫代硫酸鈉0.5克 瓊脂 15克 蒸餾水 1000mL pH 7.2 12130分鐘滅菌。(8)吲哚試驗(yàn)培養(yǎng)基蛋白胨 10克 牛肉膏

11、 5克 NaCl 5克 蒸餾水 1000mL pH 7.2 12130分鐘滅菌。(9)石蕊牛乳培養(yǎng)基：脫脂牛乳100ml（脫脂奶粉10克加10倍水稍加熱一次，冷卻，去上層油脂） pH 7.0用2.5石蕊水溶液將牛奶調(diào)至淡紫色偏藍(lán)為止（呈紫丁香色）用不摻水的新鮮牛奶反復(fù)加熱（三次）去掉脂肪，每次加熱2030分鐘，冷卻去奶油，在最后一次冷卻后，用吸管把底層牛奶吸出，棄上層奶沖。11530分鐘滅菌。(10)檸檬酸鹽培養(yǎng)基：檸檬酸鈉2.28克 NaCl 5克 硫酸鎂1克 磷酸氫二鉀1克 磷酸銨或磷酸氫二銨1克 瓊脂20克 蒸餾水1000mL pH 6.8 溴百里酚藍(lán)1的酒精溶液8mL注：調(diào)pH之后再加入指示劑，12120分鐘滅菌。指示劑的配制：1)1.6溴甲酚紫溶液溴甲酚紫 1.6克 蒸餾水 100mL2)M·R試劑（甲基紅試劑）甲基紅 0.2克 乙醇（95） 300ml 蒸餾水 200mL變色范圍pH 4.46.03)V·P試劑