植物苯丙氨酸解氨酶的生物學(xué)研究進(jìn)展

1、現(xiàn)代食品科技 Modern Food Science and Technology Vol.23 No.7(總 9771植物苯丙氨酸解氨酶的生物學(xué)研究進(jìn)展馬俊彥 1,楊汝德 1,敖利剛2(1.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510640 (2.江西省南昌市昌北國際機場邊防檢查站,江西 南昌 330114摘要:苯丙氨酸解氨酶(phenylanlanine ammonialyase, PAL, E.C.4.3.1.5作為植物次生代謝特別是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶,與植物 抵抗病原菌入侵有密切關(guān)系,具有重要的植物生理意義。本文綜述了植物 PAL 的存在與分布、分子結(jié)構(gòu)、酶學(xué)性質(zhì)和作用機制,應(yīng)

2、用酶學(xué)和分子生物學(xué)知識闡述了其表達(dá)調(diào)控機理,并在基因水平上對 PAL 的分子生物學(xué)研究進(jìn)行了展望,旨在為今后 PAL 在植物抗 病應(yīng)用上提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。關(guān)鍵詞:苯丙氨酸解氨酶;作用機制;表達(dá)調(diào)控中圖分類號:Q555+.6;文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A ;文章篇號 :1673-9078(200707-0071-05Progress in Biological Research of Phenylanlanine Ammonialyase(E.C.4.3.1.5MA Jun-yan1, YANG Ru-de1, AO Li-gang2(1.School of Biosicience and Bioengineer

3、ing, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China(2.Nanchang Changbei International Airport Frontier Inspection Station, Nanchang 330114, ChinaAbstract: As a critical enzyme in secondary metabolism of plants, especially in the first reaction of the biosynthesis of L- phenylalanine,

4、Phenylanlanine ammonialyase (PAL,E.C.5.3.1.5 has significant biological meaning and strong ability against bacteria. The distribution, molecular structure, enzymatic characters and mechanism of PAL in plants were reviewed. Meanwhile, the regulation mechanisms of PAL was introduced using enzymology a

5、nd molecular biology. The development of the researches on molecular biology of PAL at the gene level was prospected to provide basic data for the application of PAL in fruit tress disease resistant. Key words: henylanlanine ammonialyase; function mechanism; expression and regulation植物代謝分為初、次兩級代謝,苯丙

6、烷類代謝是 次級代謝途徑中很重要的一條,在苯丙氨酸解氨酶作 用下,苯丙烷類代謝完成第一步反應(yīng),生成香豆酸、 阿魏酸、芥子酸等中間產(chǎn)物,這些化合物進(jìn)一步轉(zhuǎn)化 為香豆素、 綠原酸, 也可以形成苯丙烷酸 CoA 酯, 再 進(jìn)一步代謝轉(zhuǎn)化為一系列苯丙素類化合物, 如黃酮體、 木質(zhì)素、生物堿 1,這些次生產(chǎn)物對植物生長發(fā)育、 抵御病蟲害、防紫外線及構(gòu)成植物支撐系統(tǒng)等方面具 有重要意義 2。苯丙氨酸解氨酶(phenylanlanine ammonialyase , PAL, E.C.4.3.1.5是植物次生代謝, 特別是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶和限速酶,與植物的抗病 性直接相關(guān)。 植物受病菌侵染后, 通常 PA

7、L 酶活性有 所提高,同時隨木質(zhì)素、綠原酸等抗菌物質(zhì)合成的增 加, 在植物抗病過程中起著化學(xué)屏障作用 3。 近年來, 迫于安全、生態(tài)和環(huán)境壓力,新化學(xué)農(nóng)藥的開發(fā)周期 逐年延長,開發(fā)成功率日趨下降,因而利用植物自身收稿日期:2007-04-23的防御系統(tǒng),提高植物抗病性化學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生成為今 后植物防病治蟲的新發(fā)展方向。 1 PAL的存在與分布PAL 主要存在與高等植物、 部分微生物 (絲狀真菌, 酵母及鏈霉菌和某些藻類中,動物體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)。1961年, Koukol 和 Conn 4首次從綠色植物中發(fā)現(xiàn)它,并 進(jìn)行了分離純化, 隨著對 PAL 研究的迅速展開, 在真菌、 細(xì)菌和藻類中也發(fā)現(xiàn)該酶的

8、存在。 Towers 和 Czich 5分 別在真菌和某些藻類如 Dunaliella marina中提取過 PAL 。金慶超等 6研究了苯丙氨酸解氨酶活性在玉米 抗、感品種和不同生育期與葉鞘位之間存在差異。在 玉米 (川單 10號 的不同生育期和葉鞘位中, 隨生育期的 發(fā)展和葉鞘位的下降,苯丙氨酸解氨酶活性降低。在 受紋枯病菌侵染后,抗病品種 (R15的苯丙氨酸解氨酶 活性增加的速度和程度明顯高于感病品種 (K09。胡美 嬌等 7人對熱處理后芒果、 香蕉果實果皮 PAL 活性在貯藏期間的變化與炭疽病發(fā)生的關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果 表明:果實采后經(jīng)熱處理和接種,炭疽菌可誘導(dǎo)酶活 性增強,即調(diào)動了寄

9、主組織抗性反應(yīng)提高,隨著熱效 應(yīng)減弱,果實的后熟,酶活性逐漸下降,直至果實完 熟時達(dá)最低值。在果實發(fā)病期間,酶活的高低與炭疽 病發(fā)生速度和嚴(yán)重程度密切相關(guān)。 江柯等 8采用玻珠破 壁、硫酸銨分級沉淀、凝膠過濾和離子交換等方法, 從 L-苯丙氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌株紅酵母中分離純化 PAL , 并 對其進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明:該酶分子 量約為 79.4 kD,最適反應(yīng)溫度為 40 ,最適反應(yīng) pH 為 8.5,除了 Mg 2+和 Na +,其它金屬離子如 Fe 3+、 Cu 2+、 Co 2+、 Hg 2+等對其都有明顯的抑制作用。細(xì)胞水平上, 植物的 PAL 主要分布在表皮下的細(xì)胞和微管組織

10、細(xì)胞 中; 亞細(xì)胞水平上, PAL 定位于細(xì)胞質(zhì)和一些膜細(xì)胞器 如葉綠體、白色體、線粒體、過氧化酶體等。 Jin 等 9應(yīng)用電鏡技術(shù)對 PAL 亞細(xì)胞進(jìn)行了定位測試, 發(fā)現(xiàn) PAL 分散在細(xì)胞基質(zhì)中,細(xì)胞間質(zhì)部分 PAL 活性最高。2 PAL的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和作用機制2.1 PAL的分子結(jié)構(gòu)不同來源的 PAL 分子量不同,但一般介于 220330 kD的酸性蛋白。 PAL 是多基因家族, 在一組 染色體中含有 23個 PAL 基因, 隨植物不同而異, 如 菜豆有 3個基因、 歐芹有 4個基因、 番茄有 5個基因、 而馬鈴薯 PAL 基因估計達(dá)到 4050之多。 一個酶蛋白 由四個亞基組成,多數(shù) P

11、AL 有均一亞基,分子量為 5588 kD。 不同植物中 PAL 的氨基酸組成不同, 水稻 中的 PAL 酸性成分少于小麥、 玉米、 馬鈴薯, 而中性 成分高于以上三種植物 10。2.2 PAL的誘導(dǎo)性及穩(wěn)定性PAL 是一種典型的細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)酶,具有別構(gòu)酶的 特征,在酶促反應(yīng)體系中加入誘導(dǎo)物后, PAL 基因的 轉(zhuǎn)錄活性增高。 不同來源的 PAL 其誘導(dǎo)因素不同, 成 水源等 8人用 6種生長調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)離體銀杏(Ginkgo biloba Linn葉 PAL 活性,結(jié)果表明誘導(dǎo)效果從高至 低依次為:乙烯利(ETP 、 2, 4-D 、矮狀素(CCC 、 吲哚乙酸(IAA 、脫落酸(ABA 、赤霉

12、素(GA 。 劉太國等 12人利用誘導(dǎo)藥劑水楊酸 (SA對煙草幼苗 誘導(dǎo)處理,探討了誘導(dǎo)前后感染 TMV 的煙草葉片內(nèi) PAL 活性變化規(guī)律。在抗病煙草品種 CV85中誘導(dǎo)接 種處理 8 d時產(chǎn)生一個 PAL 活性高峰, PAL 活性比對 照增加 0.22倍。 無論從癥狀表現(xiàn)還是從實驗數(shù)據(jù)來看, 水楊酸的外源應(yīng)用可以比較有效地誘導(dǎo)煙草抗病品種 產(chǎn)生抗病性,為誘導(dǎo)抗病機制用于病害的防治提供了 理論依據(jù)。郭紅蓮等 13人用磷酸氫二鉀、灰斑病菌濾 液、水楊酸和草酸作誘抗劑,研究了玉米對灰斑病的 誘導(dǎo)抗病作用, 同時測定了挑戰(zhàn)接種前后 PAL 活性的 變化。結(jié)果表明:上述三種誘抗劑均有不同程度的誘 導(dǎo)

13、抗病性,其中水楊酸誘抗效果最好,病菌培養(yǎng)濾液 和磷酸氫二鉀次之,草酸誘抗效果最差。誘導(dǎo)后挑戰(zhàn) 接種, PAL 活性都有增加,且酶活性曲線波形變化較 大。和其它酶類一樣,除受誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外, PAL 也可 經(jīng)紫外誘導(dǎo)改變其活性,孫旭東 14以番茄為試材,經(jīng) 2.4 kJ/m2 UV照射,取果皮經(jīng)冰浴研磨、硫酸銨分級 沉淀、凝膠過濾和離子交換層析,分離純化出苯丙氨 酸解氨酶, 經(jīng)測定, 紫外照射組 PAL 防御酶活性比對 照組高出 5 U/mL, 從而提高了對灰葡萄孢菌的抗病能 力。提高 PAL 的穩(wěn)定性可通過添加效應(yīng)物的方法來 實現(xiàn),張文博等 15人通過單因素實驗研究了谷氨酸 鈉、海藻酸鈉、甘油、

14、氮氣等對 PAL 的穩(wěn)定性影響, 通過正交實驗和方差分析, 確定在轉(zhuǎn)化液中加 1.0 g/L鋅粉和 20 g/L谷氨酸鈉作為效應(yīng)物, L-苯丙氨酸積累 濃度提高 55 %,該兩種效應(yīng)物對 PAL 的穩(wěn)定性增加 顯著。 岳海燕等 16人考察了聚乙二醇 6000、 D-山梨醇、 二巰基蘇糖醇、 戊二醛反應(yīng)中 PAL 活力的影響。 單因 子實驗發(fā)現(xiàn), 0.5 %聚乙二醇 6000對 PAL 酶活的影響 最大, 可提高活力 80.3 %。 響應(yīng)面實驗發(fā)現(xiàn), 海藻糖、 聚乙二醇 6000、 二巰基蘇糖醇在實驗濃度范圍內(nèi)交互 作用很小; 0.62 %海藻糖、 0.54 %聚乙二醇 6000和 0.31 %

15、巰基蘇糖醇的組合可提高酶活 92.9 %。2.3 PAL的催化作用機制PAL 催化作用機制的研究主要經(jīng)歷了三個階段: 1970年, Hason 和 Havir 率先提出米切爾加成反應(yīng)機理 (Michael Addition Reaction :即去氫丙氨酸(DHA 為 PAL 的活性中心, PAL 反應(yīng)機理方案的關(guān)鍵步驟是 L-苯丙氨酸的氨基經(jīng)由米切爾加成到 DHA 的 ß位, 這個提 法已經(jīng)由化學(xué)和突變研究證據(jù)所支持; 1994年, Schuster 和 Retey 17借助在 PAL 失活條件下,觀察轉(zhuǎn)化 4-硝基 -L-苯丙氨酸提供的實驗證據(jù),反駁了前述機理,提出了 第 二 種

16、 傅 氏 反 應(yīng) 機 理 , 即 輔 基 DHA 以 傅 氏 (Frieded-Crafts 反應(yīng)方式, 攻擊 L-苯丙氨酸芳環(huán)鄰位, 造成 C +,使 ß位質(zhì)子被酸化,從而有助于由酶催化堿基 的去除作用。在氨的前 -S-質(zhì)子消除作用去除后,該環(huán) 再度芳構(gòu)化,并重新產(chǎn)生輔基。實際上,無論上述哪 種機理, 均能解釋了 L-苯丙氨酸的氨消除模式, PAL 中 的 DHA 單位是反應(yīng)活性的關(guān)鍵;隨著化學(xué)和分子生物 學(xué)實驗證據(jù)的不斷出現(xiàn),主要基于 PAL 和 HAL(組氨酸72解氨酶 , E.C.4.3.1.3的高度同源性 (19 %29 %序列分析 及其對“姐妹”酶 HAL 的 X-射線結(jié)

17、構(gòu)分析, 2004年楊 順楷等人發(fā)現(xiàn)催化性的親電試劑并非 DHA ,而是 3,5-二氫 -5-次甲基 -4H-咪唑 -4-酮 (MIO, 由此提出一對非芳 香 L-苯丙氨酸異構(gòu)體作探針, 以支持這一機理的實驗研 究。 此外, 還列出紅酵母 PAL 逆向催化合成非天然芳族 氨基酸的相關(guān)實驗結(jié)果 18。3 PAL的表達(dá)調(diào)控前面敘述過植物 PAL 基因結(jié)構(gòu)的普遍特點是由 小的多基因家族組成,一組染色體中,一般含有 26個基因, 并且可分為 23個不同的亞族或類群。 另外, PAL 基因的編碼區(qū)長度變化不大,一般在 2000 bp左 右,如菜豆 PAL2編碼區(qū)長 2136 bp、 PAL3編碼區(qū)長 2

18、130 bp,水稻 PAL 編碼區(qū)長 2103 bp。 PAL 基因的表 達(dá)及 PAL 活性受多種因素影響, 而針對不同的影響應(yīng) 速, PAL 的表達(dá)模式不盡相同,其選擇性表達(dá)受到復(fù) 雜的調(diào)控。3.1 表達(dá)的組織特異性PAL 在植物組織中的表達(dá)具有組織特異性, 也受 發(fā)育的調(diào)控,同一 PAL 基因家族中不同 PAL 基因的 表達(dá)模式不完全相同。在大多數(shù)植物的根部和成熟的 花中 PAL 表達(dá)量最高, 莖中的表達(dá)水平中等, 而成熟 的葉片中幾乎不表達(dá),菜豆的 3個基因 PAL1、 PAL2和 PAL3都能在根部大量表達(dá) ; 芽中 PAL1和 PAL2均 有表達(dá) ; 葉中僅 PAL1有表達(dá); 花瓣中

19、 PAL2大量表達(dá), PAL1表達(dá)量很少, PAL3不表達(dá)。草莓、蘋果、梨的 果實在發(fā)育過程中, PAL 活性有兩個高峰,一個為幼 果期,一個為果實成熟期。3.2 表達(dá)調(diào)控的方式首先,對苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控受酶的內(nèi)部調(diào) 節(jié)。一方面受到苯丙烷類代謝途徑產(chǎn)物的反饋調(diào)節(jié)。 王燕等 19人曾經(jīng)通過添加前體底物和末端產(chǎn)物的方 式, 從酶學(xué)角度探討了這些物質(zhì)對 PAL 活性的影響, 分 別從促進(jìn)酶活性和抑制酶活性這兩個方向來確定誘導(dǎo) 和抑制酶活力的最適宜濃度。研究發(fā)現(xiàn), 4個濃度的反 式肉桂酸處理都能抑制酶活性, 100 mmol/L反式肉桂 酸抑制酶活性作用最強。 3,5-二氫肉桂酸除 100 mmo

20、l/L微弱地增加酶活性外,其余都抑制酶活性。 4個濃度的 4,5,7-三羥黃烷酮都能抑制酶活性,其中, 6.25 mmol/L抑制能力最強。阿魏酸除 100 mmol/L濃度增加酶活性 外,其它濃度處理都降低酶活性, 50 mmol/L抑制酶活 性最強。 另一方面, 植物體內(nèi)的一種 PAL 內(nèi)源性抑制物 質(zhì) (PAL-I參與了 PAL 活性調(diào)節(jié),這已在水稻、馬鈴薯、 蘿卜、向日葵中得到證實。從去胚乳的水稻黃化苗中 提取并部分純化 PAL-I ,它是一種非透析蛋白,具有熱 穩(wěn)定性,動力學(xué)實驗表明 PAL-I 對 PAL 的抑制是競爭 的, 它不僅能抑制水稻 PAL , 而且能抑制從玉米、 小麥、

21、 馬鈴薯塊莖切片中提取的 PAL 。其次,苯丙烷類代謝途徑的調(diào)控也受到酶的外部 因子的調(diào)節(jié)。各種類型的低溫、機械損傷、光、病原 菌感染等都可以刺激 PAL 基因的表達(dá), 在受傷害的菜豆 下胚軸組織中出現(xiàn)大量 PAL 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累。 使用生長 素(IAA 、外源乙烯、激動素 (BAP后, PAL 活性增 加;而使用 NAA 、赤霉素(GA 3后,活性減小。研 究表明,植物在生長發(fā)育過程中以及受病原物及其誘 導(dǎo)物和傷害等刺激, PAL 常伴隨植物體內(nèi)乙烯生物合成 的增加而積累。外源乙烯也能引起馬鈴薯塊莖中編碼 PAL 的 mRNA 水平的提高。用病原菌毒素處理能刺激 PAL 活性升高, 而且毒素

22、處理的作用強度大于病原菌接 種的作用強度。各種因子對 PAL 的誘導(dǎo)存在互作關(guān)系, 王敬文等 20在切傷誘導(dǎo)甘薯塊根切片 PAL 活性增高, IAA 、 BAP 能再使 PAL 活性增加,且 BAP 的效應(yīng)又可被 照射紅光而增強。3.3 表達(dá)調(diào)控的機制PAL 基因的表達(dá)受到包括生長發(fā)育、病菌感染、 環(huán)境刺激等多種因素的影響,且不同因素影響下,其 表達(dá)模式又各不相同,說明表達(dá)是受到復(fù)雜的機制調(diào) 控的, 研究啟動子的結(jié)構(gòu)有助于理解的表達(dá)調(diào)控機制。 菜豆 PAL2與木質(zhì)素前體合成有關(guān),其啟動子區(qū)域起 始密碼子上游 -289到 -74的順式作用元件對木質(zhì)部的 表達(dá)是必需的,但與在葉原基和莖的表達(dá)或在花

23、瓣建 立組織特異性無關(guān); 在 -135到 -119區(qū)域有一個負(fù)調(diào)控 元件, 它能抑制一個位于 -480到 -289區(qū)域的與韌皮部 表達(dá)相關(guān)的隱藏的順式作用元件的活性。歐芹 PAL1的啟動子區(qū)域有兩個核甘酸序列,與紫外輻射和誘導(dǎo) 反應(yīng)有關(guān),這些序列在不同種類的好幾個與誘導(dǎo)及光 反應(yīng)有關(guān)的基因中位置是保守的。在小麥的 PAL1啟 動子區(qū)也含有與在其它基因啟動子中鑒定的調(diào)控元件 高度相似的區(qū)域,這些元件包括其它的苯丙烷代謝途 徑基因的抗紫外線和在真菌誘導(dǎo)中起作用的序列以及 在植物的防御基因轉(zhuǎn)錄活化中起作用的序列。將菜豆 PAL 基因 (PAL1, PAL2 的啟動子與 GUS 報告基因融 合轉(zhuǎn)移到馬

24、鈴薯、煙草和擬南芥中,的研究表明的表 達(dá)受環(huán)境刺激因子的誘導(dǎo)調(diào)控,也受轉(zhuǎn)基因植物發(fā)育 階段調(diào)控而表現(xiàn)出不同的時空表達(dá)模式 21。4 PAL的分子生物學(xué)研究展望73國內(nèi)外對 PAL 的研究較為深入, 但主要集中在它 的提取純化、抗逆境、生理作用等方面,關(guān)于它的基 因表達(dá)和調(diào)控方面的研究還不多,需要進(jìn)一步展開更 深入更廣泛的研究。隨著分子生物學(xué)尤其是基因工程 技術(shù)的不斷發(fā)展, 已有不同來源的 PAL 基因序列被克 隆和測序,近年來研究最多也較有成果的還是構(gòu)建 PAL 基因表達(dá)系統(tǒng),現(xiàn)在已有用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、 乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的 PAL 基因工程菌的報道, 但國內(nèi)現(xiàn)在對 PAL 基因工程菌的

25、構(gòu)建工作開展不多, 隨著更多的表達(dá)系統(tǒng)的建立和現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化, 會有更多更好的 PAL 基因工程菌構(gòu)建出來, 滿足生物 化工對高性能工業(yè)生物催化菌種的需求。鑒于此, 今后對 PAL 分子生物學(xué)研究可以從以下 兩個方面入手:一是優(yōu)化現(xiàn)有的 PAL 表達(dá)系統(tǒng), 二是 開發(fā)新的 PAL 表達(dá)系統(tǒng)。對現(xiàn)有 PAL 表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行 優(yōu)化是發(fā)展高效 PAL 表達(dá)系統(tǒng)的重點, 尤其是精巧地 利用菌株的有效表達(dá)元件, 是開發(fā)好 PAL 基因工程菌 的重要途徑。 對 PAL 基因啟動子及相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn) 行分析可以進(jìn)一步闡明 PAL 基因的表達(dá)調(diào)控機理, 對 PAL 基因啟動子進(jìn)行剖析,尋求一種能高效、可控的

26、 啟動基因轉(zhuǎn)錄的啟動子,找出有關(guān)的順式作用元件將 是今后的焦點之一。 另外, 可以克隆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子, 并研究它們所編碼蛋白的功能。 PAL 調(diào)控過程主要通 過轉(zhuǎn)錄因子對生物合成基因轉(zhuǎn)錄的活化來實現(xiàn),轉(zhuǎn)錄 因子充當(dāng)著“分子開關(guān)”的作用,當(dāng)它們得到特定發(fā) 育階段所發(fā)出的信號后,將活化苯丙烷代謝途徑的特 定生物合成途徑。開展 PAL 特異性基因的結(jié)構(gòu)特點、 克隆、測序、表達(dá)部位和時空表達(dá)模式的研究,以便 有目的地用之于轉(zhuǎn)化植物, 使之在轉(zhuǎn)基因植物中大量、 持久地表達(dá),提高特定次生代謝物的產(chǎn)量?，F(xiàn)有許多外源基因表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)用于生產(chǎn)外源蛋 白, 而用于表達(dá) PAL 的似乎還很少, 故開發(fā)新的 PAL

27、表達(dá)系統(tǒng)具有很大的研究空間。如上文中提到,現(xiàn)在 已有用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、乳酸乳球菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建 的 PAL 基因工程菌的報道。此外,鏈霉素表達(dá)系統(tǒng), 芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng),甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)等都有自身的 特點, 有利于 PAL 表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建。 尤其是甲醇酵母, 它作為一種新的高效分泌型表達(dá)外源基因的宿主,近 幾年來已成為一個研究熱點。甲醇酵母中含有非常強 的甲醇氧化酶基因(methanol oxidase,MOX或 alcohol oxidase , AOX 啟動子,具備高密度發(fā)酵和分泌表達(dá) 的能力,比傳統(tǒng)的釀酒酵母(S. cerevisiae更具產(chǎn)業(yè) 化發(fā)展?jié)摿?22。 參考文獻(xiàn)1 歐陽光察 ,

28、 薛應(yīng)龍 . 植物苯丙烷類代謝的生理意義及其調(diào)控 J.植物生理學(xué)通訊 ,1988,24(3:9-162 賀立紅 , 張進(jìn)標(biāo) , 賓金華 . 苯丙氨酸解氨酶的研究進(jìn)展 J.食品 科技 ,2006(7:31-343 張淑紅 , 高寶嘉 , 溫秀軍 . 棗瘋病過氧化物酶及苯丙氨酸解氨 酶的研究 J.植物保護(hù) ,1995,30:59-624 Koukol J , Conn E E. The metabolism of aromatic compounds in higher plants.IV. Purification and properties ofthe-phenylalanine deami

29、nase of Herdeum vulagareJ. Journal of Biology and Chemistry,1961,236:2692-26985 Hanson K R, Havir E A. Phenylalanine Ammonia-LyaseJ. The Biochemistry of Plants,1981,7:578-6216 金慶超 , 葉華智 , 張敏 . 苯丙氨酸解氨酶活性與玉米對紋枯病 抗性的關(guān)系 J.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ,2003,21(2:116-118 7 胡美嬌 , 劉秀娟 , 黃圣明 . 熱處理后芒果、香蕉果皮 PAL 活性 變化與炭疽病發(fā)生的關(guān)系 J.熱

30、帶作物學(xué)報 ,2000, 21(4:63- 688 江柯 , 盧濤 , 趙德立 , 等 . 紅酵母苯丙氨酸解氨酶德分離純化及 性質(zhì)研究 J.四川大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版 ,2004, 41(4:865 -8689 Jin Nakashima, et al. Immunocytochemical localization of phenylalanine ammonia-lyase and cinnamyl alcohol dehydro -genase in differentiating tracheary elements derived from Zinnia mesophyll cells

31、J.Plant Cell Physiology,1997, 38(2: 113-12310 歐陽光察 , 應(yīng)初衍 , 等 . 植物苯丙氨酸解氨酶的研究 .VI. 水 稻、 小麥 PAL 的純化及基本特性 J.植物生理學(xué)報 ,1985,11 (2:204-214.11 成水源 , 王燕 , 劉衛(wèi)紅 , 等 . 生長調(diào)節(jié)劑對離體銀杏苯丙氨酸 解氨酶活性的影響 J.植物資源與環(huán)境學(xué)報 ,2005,14 (1:20-2212 郭紅蓮 , 陳捷 , 高增貴 , 等 . 不同誘抗劑誘導(dǎo)玉米對灰斑病的抗 性及其與 PAL 的關(guān)系 J.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ,2000,31(5:465 -46713 孫旭東 ,

32、榮瑞芬 . 短波紫外線誘導(dǎo)采后番茄苯丙氨酸解氨酶 的分離純化 J.農(nóng)產(chǎn)品加工 ,2006(8:67-7114 張文博 , 李守平 , 杜連祥 , 等 . 幾種效應(yīng)物對苯丙氨酸解氨酶穩(wěn) 定性的影響 J.生物技術(shù) ,2002,3(12:14-1615 岳海燕 , 袁其朋 , 劉曉慧 . 相應(yīng)面法分析效應(yīng)物對苯丙氨酸解 氨酶活性的影響 J.食品科技 ,2006(10:58-62(下轉(zhuǎn)第 97頁7497數(shù)據(jù)記錄、計算方法及計算結(jié)果如表 3所示:腺苷濃度 (C X =RXR A A C × 腺苷含量(%=WC X 10010506×××式中:A X -樣品峰面積;

33、 A R -對照品的峰面積平均值, 1788650; C X -樣品的濃度, µg/mL; C R -對照品的濃度:54.8 µg/mL; W -試樣重量, g表 3 色譜圖數(shù)據(jù)及樣品中腺苷含量 色譜圖 保留時間 /min樣品峰面 積 /Ax腺苷濃度 C X /(µg/mL 樣品中腺苷 含量 /% 樣品 1 5.989 143355243.92 0.219 樣品 2 5.981 144619144.30 0.222 樣品 3 5.985 164202950.31 0.252 樣品 45.980 171323852.490.262在相同的操作條件下,冬蟲夏草發(fā)酵菌絲

34、粉中腺苷組分的保留時間相同,因而采用樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的保 留時間相對照來進(jìn)行定性分析。而進(jìn)行定量分析時, 采用色譜儀的自動積分器和計算機數(shù)據(jù)處理軟件自動 測量色譜峰的全部面積,在一定濃度范圍內(nèi),組分的 濃度與所測的峰面積呈線形關(guān)系。采用濃度變化范圍 十分接近待測組分含量的腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液繪出濃度對 峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行樣品分析時,在與標(biāo)準(zhǔn)樣品嚴(yán)格相同的條件下定量進(jìn)樣,由所得峰面積在標(biāo)準(zhǔn)曲 線上測定被測組分含量。 3 結(jié)論HPLC 法測定冬蟲夏草發(fā)酵菌絲粉中腺苷含量的 色譜條件為反相鍵合的色譜柱 ODS Hypersil 5 µm, 125×4 mm; 柱溫:35 , 檢測波長 260 nm; 流動相:0.06 mol/L磷酸二氫鉀 -甲醇 -四氫呋喃(1