常用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

1、6種方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量一、微量凱氏（kjeldahl ）定氮法樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用， 變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液 被中和的程度可計(jì)算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：nh2ch2cooh+3h2so2co2+3so2+4h2o+nh3 2nh3+h2so4（n h4）2so4 （2）（nh4）2so4+2nao2h2o+na2so4+2 nh3 反應(yīng)（1）、（2）在凱氏瓶完成，反應(yīng)（3）在凱氏蒸餾裝置中進(jìn)行。為了加速消化，可以加入cuso4作催化劑，k2so4以提高溶液的沸點(diǎn)。收集 氨可用硼酸溶

2、液，滴定則用強(qiáng)酸。實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法這里從略。計(jì)算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25 即得。二、雙縮脲法（biuret法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲（nh3conhconh3）是兩個(gè)分子脲經(jīng)180°C左右加熱，放出一個(gè)分子氨 后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與 cuso4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲 反應(yīng)。凡具有兩個(gè)酰胺基或兩個(gè)直接連接的肽鍵， 或能過一個(gè)中間碳原子相連的 肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比， 而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成 分無關(guān)，故可用來測(cè)

3、定蛋白質(zhì)含量。測(cè)定圍為 1-10mg蛋白質(zhì)。干擾這一測(cè)定的 物質(zhì)主要有：硫酸銨、tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點(diǎn)是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì) 少。主要的缺點(diǎn)是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精 確的蛋白質(zhì)測(cè)定。（二）試劑與器材1試劑：（1） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白， 配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正 其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，計(jì)算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血清清蛋白用h2o或0.

4、9%nacl配制，酪蛋白用 0. 05n naoh配制。（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（cuso4?5h20和6.0克酒石酸鉀鈉（knac4h4o6?4h20，用500毫升水溶解，在攪拌下加入 300毫升10% naoh溶 液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長(zhǎng)期 保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。2. 器材：可見光分光光度計(jì)、大試管15支、旋渦混合器等。（三）操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取12支試管分兩組，分別加入0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0毫升的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用水補(bǔ)足到 1毫升，然后加入4毫升雙縮脲試劑。 充分搖

5、勻后，在室溫（2025°C）下放置30分鐘，于540nm處進(jìn)行比色測(cè)定。 用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照液。取兩組測(cè)定的平均值，以蛋白質(zhì)的含量為橫座標(biāo)，光吸收值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品的測(cè)定：取23個(gè)試管，用上述同樣的方法，測(cè)定未知樣品的蛋白 質(zhì)濃度。注意樣品濃度不要超過10mg/ml。三、folin 酚試劑法（lowry法）（一）實(shí)驗(yàn)原理這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方 法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑， 即folin 酚試劑，以

6、增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯 色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合 物。folin 酚試劑中的磷鉬酸鹽一磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基 還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白 的量成正比。folin 酚試劑法最早由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生 物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得 多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式， 且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾 lowry反應(yīng)。而且

7、對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%）， 硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%）,丙酮（0.5%） 等溶液對(duì)顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液， 只須加濃碳酸鈉一氫氧化鈉溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色 淺，則必須提高碳酸鈉一氫氧化鈉溶液的濃度12倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加folin 酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性 ph條件 下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在 ph=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)folin 一酚試劑加到堿 性的銅一蛋白質(zhì)溶液中

8、時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸一磷鎢酸試劑被破壞之 前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá) 5mg。通常測(cè)定圍是20250mg。（二）試劑與器材1試劑（1）試劑甲：（a） 10 克 na2co3, 2 克 naoh 和 0.25 克酒石酸鉀鈉 （knac4h4o6?4h2o。 溶解于500毫升蒸餾水中。（b）0.5克硫酸銅（cuso4?5h2。溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前， 將50份（a）與1份（b）混合，即為試劑甲。（2） 試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉（na2wo4?2h20 ,25 克鉬酸鈉（na2moo4?2h20

9、及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫 升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150 克硫酸 鋰（Ii2so4）, 50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步 驟）。稀釋至1升，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)naoh滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水 1倍，使最終的酸濃度為1n左右。（3） 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸 餾水，濃度為250mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用 0.9%nacl溶 液。2. 器材（

10、1）可見光分光光度計(jì)（2）旋渦混合器（3）秒表（4）試管16支（三）操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其 余試管分成兩組，分別加入0，0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶 液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑 甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（2025C）放置10分鐘。再逐管加入 0.5毫升試劑乙（folin 酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則 會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置 30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試 管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液

11、的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫 座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí) 間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入 5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已 超過10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加 入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試 劑后，再放置30分鐘，然后開始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫 好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的

12、量（毫升），并按由左至右，由上至下 的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的 吸光度值。folin 酚試劑法實(shí)驗(yàn)表管號(hào)45678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)00.10.2 0.4 0.6 0.8 1.0（250mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.2 0.4 0.6(約 250mg/ml)蒸餾水1.00.9 0.8 0.6 0.4 0.200.8 0.6 0.4試劑甲5.05.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0試劑乙0.50.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白質(zhì)的量（mg）吸光度值（a700）2.樣品的測(cè)定：取1毫

13、升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì) 20250微克），按上 述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。 通常樣品的測(cè)定也可 與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增 加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量， 從而計(jì)算出 樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意:由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨 不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度 （相對(duì) 于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。四、改良的簡(jiǎn)易folin 酚試劑法（一）試劑1試劑甲：堿性銅試劑溶液中，含 0.5n naoh 10%na2co

14、3 0.1%酒石酸鉀 和0.05%硫酸銅，配制時(shí)注意硫酸銅用少量蒸餾水溶解后， 最后加入。2.試劑乙: 與前面的基本法相同。臨用時(shí)加蒸餾水稀釋 8倍。3. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：同基本法。（二）操作步驟測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品溶液的操作方法與基本法相同。只是試劑甲改為1毫升，室溫放置10分鐘后，試劑乙改為4毫升。在55C恒溫水浴中保溫5分鐘。 用流動(dòng)水冷卻后，在660nm下測(cè)定其吸光度值。改良的快速簡(jiǎn)易法，可獲得與 folin 酚試劑法（即lowry基本法）相接近 的結(jié)果。五、考馬斯亮蘭法（bradford 法）（一）實(shí)驗(yàn)原理雙縮脲法（biuret法）和folin 酚試劑法（lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多

15、限 制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測(cè)定的方法。1976年由bradford建立的考馬斯亮蘭法（bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染 料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)， 因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法?？捡R斯亮蘭g-250染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置（Imax），由465nm變?yōu)?95nm,溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色。經(jīng)研究認(rèn)為，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比。bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是

16、：(1) 靈敏度高，據(jù)估計(jì)比lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比lowry法要大的多。(2) 測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可 以在1小時(shí)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完 全不用像lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。(3) 干擾物質(zhì)少。如干擾lowry法的k+、na+、mg2+離子、tris緩沖液、糖 和蔗糖、甘油、巰基乙醇、edta等

17、均不干擾此測(cè)定法。此法的缺點(diǎn)是：(1) 由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此bradford 法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用g球蛋白 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。(2) 仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、trito n x-100、十二烷基硫酸鈉(sds)和0.1 n的naoh°(如同0.1 n的酸干擾lowary法 一樣)。(3) 標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能 用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定未知蛋白質(zhì)的濃度。(二)試劑與器材1. 試劑：(1) 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液，用g球蛋白或牛血清清蛋白(

18、bsa),配制成1.0mg/ml 和0.1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。(2) 考馬斯亮蘭g 250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭g250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。2. 器材：(1) 可見光分光光度計(jì)(2) 旋渦混合器(3) 試管16支（三）操作方法1. 標(biāo)準(zhǔn)方法（1） 取16支試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分為兩組按 表中順序，分別加入樣品、水和試劑，即用1.0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液給各試 管分別加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用無離子水補(bǔ)充到 0.1ml。最后各試管中分別加入

19、5.0ml考馬斯亮蘭g250試劑，每加完一管，立 即在旋渦混合器上混合（注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除）。未知樣品的加樣量見下表中的第 & 9、10管。（2）加完試劑2-5分鐘后，即可開始用比色皿，在分光光度計(jì)上測(cè)定各樣 品在595nm處的光吸收值a595,空白對(duì)照為第1號(hào)試管，即0.1mlh2o加 5.0mlg250 試劑。注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿， 使用后立即用少量95%的乙醇蕩洗，以洗去染色。塑料比色皿決不可用乙醇或丙 酮長(zhǎng)時(shí)間浸泡?？捡R斯亮蘭法實(shí)驗(yàn)表管號(hào) 12345678910標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)0 0.01 0.02 0.04 0.0

20、6 0.08 0.10（1.0mg/ml）未知蛋白質(zhì)0.02 0.04 0.06（約 1.0mg/ml）蒸餾水 0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.0200.08 0.06 0.04考馬斯亮藍(lán)g 250 試劑 5.05.05.0 5.05.05.05.05.05.05.0每管中的蛋白質(zhì)量（mg）光吸收值(a595)（3）用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)，用吸光度值a595為縱座標(biāo)，作圖， 即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。由此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的 a595值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量。0.5mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.50。2. 微量法當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)濃度較稀時(shí)（1

21、0- 100mg/ml）,可將取樣量（包括補(bǔ)加的水） 加大到0.5ml或1.0ml,空白對(duì)照則分別為0.5ml或1.0ml h2o,考馬斯亮藍(lán)g 250 試劑仍加5.0ml,同時(shí)作相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定 595nm的光吸收值。0.05mg牛血清蛋白/ml溶液的a595約為0.29。六、紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在 280nm處，其吸光度（即光密度值） 與蛋白質(zhì)含量成正比。此外，蛋白質(zhì)溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長(zhǎng)下，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫

22、外吸收法簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用。低濃度 的鹽，例如生化制備中常用的（nh4） 2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測(cè)定。特別 適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，因?yàn)榇藭r(shí)只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對(duì)值。此法的特點(diǎn)是測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白 質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測(cè)定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。 若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)， 會(huì)出現(xiàn)較大的干擾。核酸 的干擾可以通過查校正表，再進(jìn)行計(jì)算的方法，加以適當(dāng)?shù)男Ｕ?。但是因?yàn)椴煌?的蛋白質(zhì)和核

23、酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測(cè)定的結(jié)果還是存在一定的誤差。此外，進(jìn)行紫外吸收法測(cè)定時(shí)，由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因ph的改變而有變化，因此要注意溶液的ph值，測(cè)定樣品時(shí)的ph要與測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的ph相一致。下面介紹四種紫外吸收法：1.280nm的光吸收法因蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm處具有最大吸收， 且各種蛋白質(zhì)的這三種氨基酸的含量差別不大，因此測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度值是最常用的紫外吸收法。測(cè)定時(shí)，將待測(cè)蛋白質(zhì)溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白質(zhì)溶液的溶劑（水 或緩沖液）作空白對(duì)照，在紫外分光度計(jì)上直接讀取280nm的吸光度值a280。蛋白質(zhì)濃度可控制在0

24、.11.0mg/ml左右。通常用1cm光徑的標(biāo)準(zhǔn)石英比色皿， 盛有濃度為1mg/ml的蛋白質(zhì)溶液時(shí)，a280約為1.0左右。由此可立即計(jì)算出蛋 白質(zhì)的大致濃度。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的光吸收值（a1% 1cm）有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)可 查，根據(jù)此光吸收值可以較準(zhǔn)確地計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。下式列出了蛋白質(zhì)濃度與（a1% 1cm）值（即蛋白質(zhì)溶液濃度為1%，光徑為1cm時(shí)的光吸收值）的關(guān)系。 文獻(xiàn)值a1% 1cm,?稱為百分吸收系數(shù)或比吸收系數(shù)。蛋白質(zhì)濃度 =(a280 ' 10 ”11cm,280nm (mg/ml)(q 1% 濃度?10mg/ml)例：牛血清清蛋白 ：a1% 1cm=6.3 (

25、280nm)溶菌酶：a1% 1cm=22.8 (280nm)若查不到待測(cè)蛋白質(zhì)的a1% 1cm值，則可選用一種與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液配制的濃度為1.0mg/ml。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為牛血清清蛋白（bsa）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取6支試管，按下表編號(hào)并加入試劑:34561.02.03.04.05.03.02.01.0 0管號(hào)12bsa (1.0mg/ml)0h2o5.04.0a280用第1管為空白對(duì)照，各管溶液混勻后在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度a280，以a280為縱座標(biāo)，各管的蛋白質(zhì)濃度或蛋白質(zhì)量（mg）為橫座標(biāo)作圖, 標(biāo)準(zhǔn)

26、曲線應(yīng)為直線，利用此標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測(cè)出的未知樣品的 a280值，即可查 出未知樣品的蛋白質(zhì)含量，也可以用 2至6管a280值與相應(yīng)的試管中的蛋白質(zhì) 濃度計(jì)算出該蛋白質(zhì)的al% 1cm,280nm2. 280nm和260nm的吸收差法核酸對(duì)紫外光有很強(qiáng)的吸收，在280nm處的吸收比蛋白質(zhì)強(qiáng)10倍（每克）， 但核酸在260nm處的吸收更強(qiáng)，其吸收高峰在260nm附近。核酸260nm處的消 光系數(shù)是280nm處的2倍，而蛋白質(zhì)則相反，280nm紫外吸收值大于260nm的 吸收值。通常：純蛋白質(zhì)的光吸收比值：a280/a260 ? 1.8純核酸的光吸收比值：a280/a260 ? 0.5含有核酸的蛋白

27、質(zhì)溶液，可分別測(cè)定其 a280和a260,由此吸收差值，用下 面的經(jīng)驗(yàn)公式，即可算出蛋白質(zhì)的濃度。蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.45 a280- 0.74 :a260此經(jīng)驗(yàn)公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核 酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。3. 215nm與225nm的吸收差法蛋白質(zhì)的稀溶液由于含量低而不能使用280nm的光吸收測(cè)定時(shí)，可用215nm與225nm吸收值之差，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法來測(cè)定蛋白質(zhì)稀溶液的濃度。用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，配制成 20100 mg/ml的一系列5.0ml的蛋白質(zhì) 溶液，分別測(cè)定215nm和225nm的吸光度值，并計(jì)算出吸收差：吸收差 d= a215 a225以吸收差d為縱座標(biāo)，蛋白質(zhì)濃度為橫座標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)出未知樣 品的吸收