水稻JAZ家族抗逆相關(guān)基因的鑒定和功能分析

1、水稻 JAZ 家族抗逆相關(guān)基因的鑒定和功能分析植物感受干旱、高鹽等逆境 , 激發(fā)內(nèi)源信號傳遞系統(tǒng) , 調(diào)節(jié)非生物脅迫應答和適應相關(guān)基因表達 , 進而適應不利環(huán)境。水稻對非生物逆境脅迫的響應涉及到生理和分子水平的調(diào)控過程。尋找抗逆相關(guān)的調(diào)控基因?qū)﹃U明水稻對非生物逆境脅迫的響應機制以及指導水稻抗逆性遺傳改良具有重要意義。JAZ 是茉莉酸信號響應途徑中的負調(diào)控因子。水稻中大部分 JAZ 家族的基因都受到非生物逆境脅迫的誘導表達。我們對 6個在逆境脅迫芯片數(shù)據(jù)中受到誘導表達的JAZ 基因轉(zhuǎn)化水稻品種中花11(Oryzasativa L. ssp japonica)。對超量表達轉(zhuǎn)基因材料進行進行了苗期逆

2、境脅迫表型篩選。其中兩個基因(OsJAZl 和 OsJAZ9)的轉(zhuǎn)基因材料分別對干旱和鹽脅迫表現(xiàn)出較為明顯的表型。本研究對這兩個參與到JA 信號傳遞和非生物逆境脅迫應答的JAZ 基因做了更加深入的功能分析 , 主要結(jié)果如下： 1. OsJAZ1受到逆境脅迫誘導表達。 OsJAZ1的超量表達植株相比對照旱敏感, 而對 ABA處理相比對照不敏感； 而 OsJAZ1功能缺失突變體植株相比對照抗旱, 卻對 ABA處理相比對照敏感。OsJAZ1功能缺失突變體材料中干旱脅迫后上調(diào)表達的基因數(shù)目比與OsJAZ1的超量表達植株和野生型的干旱誘導上調(diào)的基因數(shù)目明顯要多。OsJAZ1在酵母中與 OsMYC2互作

3、, 它和 OsCOI1a的互作依賴于冠菌素。OsJAZ1超量表達和 OsJAZ1功能缺失突變體的表型可能和ABA響應的基因有關(guān) , 篩選酵母雙雜交文庫獲得一個OsJAZ1的互作蛋白 bZIP 類型轉(zhuǎn)錄因子 OsBZ8,雙分子熒光互補實驗和酵母雙雜交點對點實驗驗證了OsJAZ1能和它互作。OsJAZ1和 OsBZ8的全長在酵母中都沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。OsBZ8的表達量受到逆境誘導表達, 其啟動子上有多個逆境相關(guān)的順式作用元件。熒光素酶實驗結(jié)果說明OsJAZ1具有轉(zhuǎn)錄抑制子的功能 . OsBZ8 能夠結(jié)合到多個 ABA相關(guān)基因的啟動子的ABRE順式作用元件上。OsJAZ1l 能抑制 OsBZ8的轉(zhuǎn)錄

4、激活活性。此外 ,OsJAZ1 也可以與 OsNINJA互作 , 它們可能和 OsBZ8組成的蛋白復合體調(diào)控下游基因的表達 , 繼而調(diào)控水稻對干旱脅迫的應答。2. OsJAZ9 抑制表達轉(zhuǎn)基因水稻的表型是相比對照對鹽脅迫敏感。OsJAZ9超量表達和 OsJAZ9抑制表達材料鹽脅迫之后地上部分的Na+/K+也顯著不同。OsJAZ9抑制表達材料對JA 敏感表型以及酵母雙雜交和pull-down實驗結(jié)果都驗證了 OsJAZ9和 OsCOIla 的互作 , 這也說明 OsJAZ9在 JA信號傳遞中起著作用。OsAKTl, OsHAK10, OsHAK21和 OsHAK27的表達模式在 OsJAZ9的超

5、量表達和抑制表達植株之中不同。受到 JA 處理調(diào)控的三個離子通道轉(zhuǎn)運蛋白OsSKCl,OsHAK21和 OsHAK27在OsJAZ9超量表達材料中對JA 處理的表達模式和野生型以及OsJAZ9抑制表達材料相反。通過酵母雙雜交文庫篩選篩選到了OsJAZ9的互作蛋白 OsNINJA和OsbHLH062。雙分子熒光以及酵母雙雜交的實驗結(jié)果都說明了OsJAZ9可以和水稻 bHLH轉(zhuǎn)錄因子 OsbHLH062和 OsNINJA互作 . OsNINJA能和水稻中大部分JAZ蛋白互作。OsNINJA和 OsJAZ9的 TIFY 結(jié)構(gòu)域互作 , 而 OsbHLH062和 OsJAZ9的 Jas 結(jié)構(gòu)域互作 ,

6、OsNINJA和 OsbHLH062與 OsJAZ9的互作位點沒有重合部分。OsbHLH062只能和水稻中的OsJAZ8, OsJAZ9和 OsJAZ11這三個 JAZ蛋白互作。酵母單雜交和凝膠電泳遷移的實驗結(jié)果說明OsbHLH062能夠特異結(jié)合到同時受 OsJAZ9和 JA 調(diào)控的離子通道蛋白基因啟動子的順式作用元件E-box 上。用水稻原生質(zhì)體瞬時表達系統(tǒng)對OsbHLH062,OsNINJA和 OsJAZ9的轉(zhuǎn)錄活性進行了分析 , 結(jié)果表明 OsbHLH062能夠激活下游基因的轉(zhuǎn)錄, 而 OsNINJA和OsJAZ9自身是轉(zhuǎn)錄抑制子 , 也能抑制 OsbHLH062介導的轉(zhuǎn)錄激活。 這些結(jié)果表明OsNINJA-OsJAZ9-OsbHLH062以轉(zhuǎn)錄復合體形式調(diào)控JA響應相關(guān)下游基因的表達,繼而影響水稻對外界脅迫的響應。前人報道中 JAZ 蛋白的互作蛋白很多 , 但關(guān)于互作蛋白和復合體在非生物逆境中應答起到的作用卻很少報道。 本研究著重研究了水稻中兩個不同的JAZ 蛋白及其互作的轉(zhuǎn)錄激活類型的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄抑制子OsNINJA的相互作用對非生物逆境應答的影響 , 其中 OsJAZ1的互作蛋白 OsBZ8結(jié)合到 ABRE順式作用元