實驗三 細(xì)菌的分離培養(yǎng)及移植PPT課件

1、 兩個概念： 在細(xì)菌學(xué)檢驗中，細(xì)菌的分離培養(yǎng)是重要的基本技術(shù)之一。 分離：從混雜微生物中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法； 純培養(yǎng)：一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細(xì)菌都是由一個細(xì)胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。第1頁/共21頁1 1 掌握細(xì)菌分離培養(yǎng)的基本要領(lǐng)和方法2 2 掌握挑菌、純培養(yǎng)及移植技術(shù)3 3 了解細(xì)菌的菌落形態(tài)及其在各種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀第2頁/共21頁球球1 1 菌種：大腸桿菌斜面、大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的混合培養(yǎng)肉湯等；2 2 培養(yǎng)基：普通肉湯、普通瓊脂斜面、普通瓊脂平板3 3 器械：剪刀、記號筆、酒精燈、接種環(huán)第3頁/共21頁1. 1. 平板劃線分離法平板劃線分離法 菌種被其他雜菌污染時

2、或混合菌懸液常用平板劃線法進(jìn)行純種分離。 此法是借助將蘸有混合菌懸液的接種環(huán)在平板表面多方向連續(xù)劃線，使混雜的微生物細(xì)胞在平板表面分散，以求得到分散的由單個微生物細(xì)胞繁殖而成的菌落，從而達(dá)到純化目的。第4頁/共21頁劃線培養(yǎng)時注意問題：劃線培養(yǎng)時注意問題：(1) 左手持皿，用左手拇指、食指及中指將平皿左手持皿，用左手拇指、食指及中指將平皿揭揭開約呈開約呈20的角度的角度(圖圖1)；(2) 右手持接種環(huán)，右手持接種環(huán)，灼燒冷卻灼燒冷卻后從混合培養(yǎng)肉湯中后從混合培養(yǎng)肉湯中取取少量涂布少量涂布于培養(yǎng)基邊緣，開始劃線于培養(yǎng)基邊緣，開始劃線(圖圖2)；(3) 劃線前先將劃線前先將接種環(huán)稍稍彎曲接種環(huán)稍稍

3、彎曲，使之易，使之易與瓊脂面與瓊脂面平行，不致劃破培養(yǎng)基；平行，不致劃破培養(yǎng)基；(4) 劃線中劃線中不易不易過多的過多的重復(fù)舊線重復(fù)舊線，以免形成菌苔；，以免形成菌苔；(5) 接種完畢，在皿底接種完畢，在皿底作好標(biāo)記作好標(biāo)記（菌名、日期、接（菌名、日期、接種者等），種者等），平皿倒扣平皿倒扣，置于，置于37培養(yǎng)。培養(yǎng)。 圖2 2 連續(xù)劃線法 區(qū)劃線法圖1 劃線分離示意圖第5頁/共21頁2.2.純培養(yǎng)的獲得與移植法純培養(yǎng)的獲得與移植法 -瓊脂斜面分離法瓊脂斜面分離法 將將37下培養(yǎng)下培養(yǎng)24h的平板從溫箱取出，挑取的平板從溫箱取出，挑取單個菌落，鏡檢單個菌落，鏡檢不含雜菌不含雜菌，即用接種環(huán)，即

4、用接種環(huán)挑取挑取單個菌落單個菌落移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，所得的培養(yǎng)移植于瓊脂斜面培養(yǎng)，所得的培養(yǎng)物即為物即為純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物。第6頁/共21頁圖3 3 斜面接種時試管的拿法 圖4 4 斜面接種時無菌操作的程序 左手斜持菌種管和被接種瓊脂斜面管，使管口相互并齊，管底部放在拇指和食指之間，松動兩管塞子，以便接種時易拔出（圖3）。 右手持接種棒，右手持接種棒，火焰滅菌火焰滅菌后，用右手小后，用右手小指和無名指并齊同時拔出兩管塞，將管口指和無名指并齊同時拔出兩管塞，將管口進(jìn)行火焰滅菌，使其靠近火焰。進(jìn)行火焰滅菌，使其靠近火焰。 將接種環(huán)將接種環(huán)深入菌種管內(nèi)深入菌種管內(nèi)，先在無菌生長，先在無菌生長的的瓊脂

5、上接觸瓊脂上接觸使之使之冷卻冷卻，再，再挑取少許細(xì)菌挑取少許細(xì)菌后拉出接種環(huán)立即后拉出接種環(huán)立即放入另一斜面培養(yǎng)基放入另一斜面培養(yǎng)基上，上，勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部。勿碰及斜面和管壁，直達(dá)斜面底部。 從從斜面底部開始劃曲線，向上至斜面頂斜面底部開始劃曲線，向上至斜面頂端為止端為止，管口通過火焰滅菌，塞好棉塞，管口通過火焰滅菌，塞好棉塞，滅菌接種環(huán)，作好標(biāo)記，置于滅菌接種環(huán)，作好標(biāo)記，置于3737溫箱培溫箱培養(yǎng)。（圖養(yǎng)。（圖4 4）2.1 2.1 兩試管間的斜面移植兩試管間的斜面移植第7頁/共21頁2.2 2.2 平板到試管斜面移植平板到試管斜面移植 手執(zhí)接種棒，火焰滅菌，手執(zhí)接種棒，火焰

6、滅菌，左手打開平皿蓋左手打開平皿蓋，將接種，將接種環(huán)置于平皿蓋上使之冷卻；環(huán)置于平皿蓋上使之冷卻； 挑取可疑的菌落挑取可疑的菌落，左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，左手蓋上平皿蓋后立即取斜面管，深入斜面管中，從深入斜面管中，從斜面底部開始劃曲線，向上至斜面斜面底部開始劃曲線，向上至斜面頂端為止頂端為止； 管口通過火焰滅菌，塞好棉塞，滅菌接種環(huán)，作好管口通過火焰滅菌，塞好棉塞，滅菌接種環(huán)，作好標(biāo)記，置于標(biāo)記，置于3737溫箱培養(yǎng)。溫箱培養(yǎng)。第8頁/共21頁 當(dāng)組織病料中含病原菌少，或有抗菌藥殘留時，用瓊脂斜面或平板分離法可能無菌落長出，為提高由病料中分離培養(yǎng)細(xì)菌的機(jī)會，這時可以無菌操作剪取一小塊病料

7、直接投入肉湯，經(jīng)37培養(yǎng)，在肉湯中長出細(xì)菌后，觀察其在液體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)，再用瓊脂斜面或瓊脂平板分離。3.3.營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)法營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)法 第9頁/共21頁4.4.穿刺培養(yǎng)法穿刺培養(yǎng)法 半固體移植半固體移植多用穿刺法接種。多用穿刺法接種。 方法基本與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接種針方法基本與純培養(yǎng)接種相同，不同的是用接種針挑取菌落，挑取菌落，垂直刺入培養(yǎng)基垂直刺入培養(yǎng)基內(nèi)。從培養(yǎng)基表面的內(nèi)。從培養(yǎng)基表面的中中部一直刺入管底部一直刺入管底，然后按，然后按原方向退出原方向退出即可。即可。第10頁/共21頁5.5.傾注培養(yǎng)法傾注培養(yǎng)法 取三支預(yù)先準(zhǔn)備的普通瓊脂培養(yǎng)基試管，加熱融化，冷至約

8、50用火焰滅菌接種環(huán)釣取待分離物接種至第一管內(nèi)，充分搖勻后，自第一管取一接種環(huán)內(nèi)容物至第二管，以同樣方法自第二管移種至第三管。然后分別傾注一個已滅菌的平皿，凝固后倒轉(zhuǎn)置于37溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。結(jié)果多數(shù)細(xì)菌在瓊脂內(nèi)生長成菌落，僅少數(shù)菌落出現(xiàn)在表面，通常第一個平板內(nèi)的菌落數(shù)較多而密集，第二、三個平板則逐漸減少，可見單個菌落。6.6.芽胞需氧菌分離培養(yǎng)法芽胞需氧菌分離培養(yǎng)法 如果被檢材料中可疑有帶芽孢的細(xì)菌，可先將被檢材料加少量生理鹽水或肉湯，置于80水浴箱中維持1520分鐘，再進(jìn)行培養(yǎng)。材料中若有帶芽孢的細(xì)菌仍可存活而生長繁殖，不耐熱的細(xì)菌繁殖體則被殺滅。第11頁/共21頁7.7.利用化學(xué)藥品的分

9、離培養(yǎng)法利用化學(xué)藥品的分離培養(yǎng)法 (1)抑菌作用: 有些藥品對某些細(xì)菌有極強(qiáng)的抑制作用，而對另外一些細(xì)菌沒有抑制作用，所以可利用這種特性進(jìn)行細(xì)菌的分離。(2)殺菌作用: 將病料如結(jié)核病料用15硫酸溶液處理，其他雜菌均被殺死，而結(jié)核桿菌因具有抗酸性而存活。(3)鑒別作用: 利用細(xì)菌對某種糖的分解能力，通過培養(yǎng)基中指示劑的變化來鑒別某種細(xì)菌。8.8.通過實驗動物分離法通過實驗動物分離法 被檢病料中疑有某種病原菌存在，將病料無菌取出，無菌研磨后加35倍量無菌生理鹽水制成混懸液，吸取一定量混懸液注射（肌肉、腹腔、皮下或靜脈）入易感實驗動物，待實驗動物死后，取其臟器，?？煞蛛x到純的病原菌。第12頁/共2

10、1頁 細(xì)菌接種后，直接放在恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，可以使需氧菌與兼性厭氧菌生長繁殖；但對厭氧菌，則需將培養(yǎng)環(huán)境或培養(yǎng)基中的氧氣除去，或?qū)⒀趸臀镔|(zhì)還原，降低其氧化還原電勢，才能生長繁殖。在有氧的環(huán)境下，培養(yǎng)基的氧化還原電勢較高，不適于厭氧菌的生長。為使培養(yǎng)基降低電勢，降低培養(yǎng)環(huán)境的氧分壓是十分必要的。 現(xiàn)有的厭氧培養(yǎng)法很多，主要有生物學(xué)法、化學(xué)法和物理學(xué)法，可根據(jù)各實驗室的具體情況而選用。第13頁/共21頁(1) 動物組織及其他物質(zhì)加入法：在液體培養(yǎng)基內(nèi)加入肝臟、腎臟等動物臟器，因其中的半胱氨酸的一SH基極不穩(wěn)定，為強(qiáng)還原劑。(2) 共棲培養(yǎng)法：將厭氧菌與需氧菌共同培養(yǎng)在同一個平皿內(nèi)，利用需氧菌的生長繁

11、殖將氧氣消耗后，造成厭氧環(huán)境利于厭氧菌生長。1. 1. 生物學(xué)法生物學(xué)法2. 2. 化學(xué)方法化學(xué)方法 利用還原能力強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)，將環(huán)境或培養(yǎng)基內(nèi)的氧氣消耗，或還原氧化型物質(zhì)，降低氧化-還原電勢。(1) 焦性沒食子酸法: 平板培養(yǎng)法、Buchner氏試管法、史氏厭氧培養(yǎng)法、平皿厭氧培養(yǎng)法 、玻罐或干燥器法(2) 李伏夫（B.M.JIbBOB）氏法 (3) 硫乙醇酸鈉法：液體培養(yǎng)基法、固體培養(yǎng)基法 3. 3. 物理學(xué)方法物理學(xué)方法 厭氧罐法、真空干燥器法、加熱密封法、高層瓊脂柱第14頁/共21頁（一）細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)（一）細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)1.1.瓊脂平皿上的生長表現(xiàn)瓊脂平皿

12、上的生長表現(xiàn) ：細(xì)菌于固體培養(yǎng)基表面生長繁殖，形成單個肉眼可見的細(xì)菌集落群體，稱為菌落。各種細(xì)菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鑒別某種細(xì)菌。 葡萄球菌在瓊脂平皿上，由于產(chǎn)生色素的不同，形成各種顏色的圓形而突起的菌落；炭疽桿菌形成扁平干燥，邊緣不整齊的火焰狀菌落，用放大鏡觀察時，呈卷發(fā)樣構(gòu)造；腸道桿菌屬的細(xì)菌，形成圓形、濕潤、粘稠、扁平、大小不等的菌落；巴氏桿菌和豬丹毒桿菌，形成細(xì)小露珠狀菌落。觀察菌落的方法除肉眼外，還可用放大鏡，必要時也可用低倍顯微鏡進(jìn)行檢查。( (見圖5-6)5-6)第15頁/共21頁圖5 菌落的形態(tài)從左到右，從上到下分別是：1.圓形、邊緣整齊、表面光滑；2圓形、

13、邊緣整齊、表面有同心圓；3圓形、葉狀邊緣、表面有放射狀皺褶；4圓形、鋸齒狀邊緣、表面較不光滑；5不規(guī)則形、波浪狀邊緣、表面有不規(guī)則皺紋；6圓形、邊緣殘缺不全、表面呈顆粒狀；7毛狀 ；8根狀第16頁/共21頁圖6 菌落的隆起度左到右，上到下：1扁平狀； 2低隆起；3隆起；4臺狀； 5臍狀；6紐扣狀；7乳頭狀；8褶皺凸面第17頁/共21頁2.2.瓊脂斜面上生長表現(xiàn)瓊脂斜面上生長表現(xiàn) 將各種細(xì)菌分別以接種針直線接種于瓊脂斜面上（自底部向上劃一直線），培養(yǎng)后觀察其生長表現(xiàn)。(見圖7 )3 3瓊脂柱穿刺培養(yǎng)中的生長表現(xiàn)瓊脂柱穿刺培養(yǎng)中的生長表現(xiàn) 將各種細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于瓊脂柱中，培養(yǎng)后觀察其生長表現(xiàn)。(見圖8)圖7 瓊脂斜面培養(yǎng)的菌落表現(xiàn)圖8 瓊脂柱穿刺培養(yǎng)的菌落表現(xiàn)1.線狀；2棘狀；3珠狀；4絨毛狀；5根狀第18頁/共21頁（二）細(xì)菌在明膠柱穿刺培養(yǎng)中的生長表現(xiàn)（二）細(xì)菌在明膠柱穿刺培養(yǎng)中的生長表現(xiàn) 取大腸桿菌、枯草桿菌和其他細(xì)菌分別以接種針穿刺接種于明膠柱， 置22溫箱中培養(yǎng)后觀察其液化情況，不同細(xì)菌對明膠柱的液化作用各不相同(見圖9)。（三）細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn)（三）細(xì)菌在液體培養(yǎng)基中的生長表現(xiàn) 將馬腺疫鏈球菌、綠膿桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌、炭疽桿菌等分別接種于肉湯中，培養(yǎng)后觀察其