園林植物遺傳育種學(xué)試驗參考指導(dǎo)書(共41頁)

1、園林植物遺傳育種學(xué)試驗參考指導(dǎo)書園林植物遺傳育種學(xué)課程實驗指導(dǎo)書園林專業(yè)楊泉女 鄧日烈 劉曉輝 編佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院園藝系2008年5月目 錄實驗一、園林植物品種性狀的描述 2 實驗二、園林植物種質(zhì)資源調(diào)查3實驗三、花粉生活力的鑒定5實驗四、園林植物開花習(xí)性的觀察與授粉技術(shù)7 實驗五、人工誘發(fā)植物多倍體9 實驗六、植物培養(yǎng)基的配制與滅菌11 實驗七、園林植物的組織培養(yǎng)13 實驗一、園林植物品種性狀的描述植物表型變異類型的觀察植物表型變異的研究是進(jìn)行表型選擇的工作基礎(chǔ)，經(jīng)過表型選擇出來的類型r一般就直接稱為優(yōu)良類型，這些優(yōu)良類型一方面可直接供生產(chǎn)之需，另一方面可作為該植物種進(jìn)一步改良的

2、原始材料。一、實驗?zāi)康?通過實驗初步掌握植物表型變異類型劃分的原理和方法。二、實驗用具 手持放大鏡、鉛筆、繪圖紙、枝剪、小刀、米尺。三、實驗材料 各種樹木和花卉品種。 四、實驗內(nèi)容 (一)樹木形態(tài)特征變異的觀察 (1)葉子形態(tài)特征的變化。許多喬灌木樹種葉子的結(jié)構(gòu)和色澤存在一定的變化，并在綠化事業(yè)上廣泛應(yīng)用著，如園柏的針葉有刺葉和鱗葉之分；槭樹和黃盧的紅葉中，存在深紅、淡紅和黃色三種類型；李子樹中還發(fā)生了保持全年樹葉紫紅的變異，這就是紅葉李；各種楊樹、柳樹的葉形和葉片大小也存在著一定的差異。 (2)果實(球果)形態(tài)特征的變異。果實(球果)是樹木重要的繁殖器官，也是劃分種、品種和類型的重要的性狀特

3、征。核桃果實按形狀可劃分為：尖頂、卵果、長果、圓果、方果等五種類型：按種殼光滑程度可分為光、中等光滑和有皺溝三種類型：接種殼厚度及其內(nèi)壁構(gòu)造(內(nèi)壁褶、內(nèi)壁膜、種殼)可劃分為露仁、薄殼、錦仁、夾綿、夾仁、節(jié)子等六大類型。 (3)樹皮形態(tài)特征的變化。許多樹種樹皮的色澤、光滑度、裂縫的狀況(形狀、深裂度、裂縫的色澤)和裂片的形狀均存在一定的差別，如楊樹、柳樹、榆樹飛泡桐和松樹等樹種均可見到。 (4)樹木冠形和分枝習(xí)性的變化。樹木的冠形和分枝習(xí)性是重要的經(jīng)濟(jì)指標(biāo)之一。特別是在綠化事業(yè)上非常重視這些性狀。樹木的冠形，例如園柏、鉛筆柏等樹種可分為塔型（尖塔型、圓錐狀塔型、圓柱狀塔型），橢圓形和卵形等形狀。

4、樹木的分枝習(xí)性以雪松為例，可分類水平狀、下垂?fàn)睿ㄋ詈秃藸睿?、斜展?fàn)詈蜐舛葼畹人姆N形式。另外在園林綠化中的扭枝狀，如龍爪柳、龍爪桑，垂枝狀如龍爪槐、垂柳、線柏等。 （二）花卉植物形態(tài)特征變異的觀察 花瓣形態(tài)特征的變化，在許多花卉植物中有單瓣型、重瓣型、皺瓣型等。重瓣型除觀察價值提高外，在某些可做食品或提取香精的種類中，還提高了它們的經(jīng)濟(jì)價值。在平展的花瓣上發(fā)生卷曲，波緣或皺折，可大大增加觀賞價值。五、實驗作業(yè) 通過觀察，詳細(xì)記載兩種樹木或花卉的變異類型特征，并用繪圖、拍照等方法加以說明，寫出觀察報告。實驗二、園林植物種質(zhì)資源調(diào)查一、實驗?zāi)康?通過對園林植物的品種資源進(jìn)行調(diào)查研究，掌握鑒定品種特

5、性的方法，了解品種間和品種內(nèi)的變異。 二、實驗材料 喬木：短穗魚尾葵（Caryota mitis）；大花紫薇（Lagerstroemia speciosa）；黃槐（Cassia surattensis）；雞蛋花（Plumeria rubra acutifolia）。灌木：棕竹（Rhapis excelsa）；紅檵木（Loropetalum chinense rubrum）；變?nèi)~木（Codiaeum variegatum pictum）；紅桑（Acalypha wilkesiana）；馬纓丹（Lantana camara）；軟枝黃蟬（Allamanda cathartica）；福建茶（Carmo

6、na microphylla）。草本：水鬼蕉（Hymenocallis Americana）；艷山姜（Alpinia zerumbet 'variegata'）?；ɑ埽翰嗜~草（Coleus blumei）；梔子（Gardenia jasminoides）；千日紅（Gomphrena globosa）；長春花（Catharanthus roseus）。三、實驗用具 測高器、標(biāo)桿、皮尺、鋼卷尺、直尺、鉛筆、記錄板等。 四、實驗內(nèi)容 觀測不同植物品種的園林與經(jīng)濟(jì)性狀，包括株型、花、果實、抗性等特征，對其進(jìn)行比較和評價。具體觀測性狀如下： 1 株型：包括株高、枝下高、冠長、冠幅（株幅）

7、、冠形、分枝角度、分枝數(shù)、枝葉的特征、植株生長情況等。 2 花的特征：包括花期、花型、花朵大小、花色、花香、開花數(shù)量等。 3 結(jié)實情況：包括果實的形狀、大小、多少等。 4 抗性：包括抗寒性、抗熱性、抗旱性、抗病性、抗蟲性、耐陰性等。 5 特殊的經(jīng)濟(jì)價值或園林價值 五、實驗方法與操作步驟 1 每 4 5 人為 1 組，每小組測量 2 3 個品種。每小組測量該品種 4-5株。 2 每株都應(yīng)按要求調(diào)查的內(nèi)容進(jìn)行觀測記載。 3 數(shù)量性狀一般按三級記載，比如： 香味：濃、一般、較淡 花量或結(jié)實：多、中等、少 抗性：強(qiáng)、中、弱 六、作業(yè)及思考題 1自己設(shè)計并填寫好不同品種間性狀差異表。 2對不同品種的綜合

8、性狀及立地條件進(jìn)行評估。3談?wù)剤@林植物品種資源研究的方法和意義。舉例：大花紫薇（Lagerstroemia speciosa）千屈菜科（Lythraceae） 1.一般特性：大喬木，高可達(dá)20米。2.葉：葉具短柄，革質(zhì)，矩圓形橢圓形或者卵狀橢圓形，長1025厘米，寬610厘米，先端鈍或短漸尖。3.花：花淡紅色，直徑約5厘米，排成一大而頂生的圓錐花序；萼有棱或槽口，被秕糠狀柔毛，裂片外反；花瓣6枚，矩圓形或倒卵形，具短柄，長2.53.5厘米；雄蕊100200枚。4.花期：夏秋間。5.果：蒴果球形，長約2.5厘米。6.生態(tài)分布：印度至中國南部。7.備注：為一美麗的庭院園林植物，木材堅挺，耐朽力強(qiáng)，

9、色紅而亮，極宜于制造家具，舟車，橋梁，電柱，建筑等用，其在經(jīng)濟(jì)上的價值足與柚木比擬。棕竹（Rhapis excelsa）檳榔科（棕櫚科）（Palmaceae） 1.一般特性：灌木，高23米。2.葉：掌狀410深裂，裂片擴(kuò)展，邊和中脈上有極小的暗褐色的鋸齒，先端闊，有不規(guī)則的齒缺，中脈間有網(wǎng)脈；葉柄扁平，邊多少粗糙，基部有纖維。3.花：花序短于葉，生于葉叢中；佛焰苞數(shù)枚，淡黃色，膜質(zhì)，被毛；花黃色，無柄，小。4.花期：5月。5.果：球形，直徑810毫米。6.生態(tài)分布：中國和日本。7.備注：庭園和盆栽園林植物，廣州常見栽培。干直而靱，可為手杖、鞭、傘柄等。艷山姜（Alpinia zerumbet

10、'variegata'）姜科（Zingiberales）1.多年生草本。 2.葉片披針形，頂端漸尖而有一旋卷的小尖頭，邊緣具柔毛，余無毛或有時于下面被毛。 3.圓錐花序成總狀花序式，下垂。苞片白色，頂端及基部粉紅色，花萼近鐘狀，萼片乳白色，4.頂端粉紅，唇瓣匙狀，寬卵形，黃色而有紫紅色條紋。 5.蒴果球形，被毛，有條紋，熟時橙紅色。 6.分布于我國東南部至西南部，亞洲熱帶其他地區(qū)也有，生于林蔭下， 7.種子供藥用，有燥濕祛寒，健脾胃之效。實驗三、花粉生活力的鑒定花期不遇給雜交工作造成困難，有的園林植物可通過調(diào)整花期來解決，有的則不得不進(jìn)行花粉貯藏，或者從外地寄運(yùn)花粉。為了避免雜

11、交工作失誤，在使用外地寄來的花粉或經(jīng)過一段時間貯藏的花粉之前，必須對花粉的生活力進(jìn)行檢測，以便提高雜交效率。因此我們必須掌握花粉貯藏及花粉生活力測定的原理和技術(shù) 一、實驗?zāi)康?掌握花粉貯藏及花粉生命力鑒定的方法和原理。 二、實驗材料 一串紅、矮牽牛、油茶等植物的花粉。 三、儀器及藥品 載玻片、蓋玻片、解剖針、鑷子、毛筆、干燥器、小指形管、標(biāo)簽、記號筆、顯微鏡、天平、燒杯、培養(yǎng)皿、滴管、玻璃棒、量筒、電爐、石棉網(wǎng)、冰箱； 凡士林、無水氯化鈣、蔗糖、瓊脂、蒸餾水、硼酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碘、碘化鉀、氯化二苯基四氮唑（ TTC ）。 四、實驗原理 花粉在低溫（ 0 2 ）、干燥、黑暗等條件下代

12、謝強(qiáng)度降低，花粉貯藏的原理就是要創(chuàng)造這樣低代謝的環(huán)境條件，從而延長花粉的壽命。 花粉的形態(tài)、花粉中酶的活性以及積累淀粉的多少（淀粉質(zhì)花粉）通常與其生活力密切相關(guān)，因此可以利用花粉的形態(tài)觀察、過氧化物酶、脫氫酶的活性高低、淀粉的含量以及在人工培養(yǎng)基上花粉管萌發(fā)的情況作為鑒定花粉生活力高低的標(biāo)準(zhǔn)。 鑒定花粉生活力的方法很多，概括起來主要有如下幾種： 1 直接測定法： 將待測花粉直接授粉，然后統(tǒng)計結(jié)實情況。此法最準(zhǔn)確，但需時較長，且實驗結(jié)果易受氣候條件的影響。也可在授粉后隔一定時間切下柱頭，在顯微鏡下壓片檢查花粉的萌發(fā)情況，根據(jù)萌發(fā)率的高低來鑒定花粉的生活力。 2 形態(tài)觀察法： 直接在顯微鏡下觀察花

13、粉的形態(tài)，根據(jù)品種花粉的典型性（如具有正常的大小、形狀、色澤等）判斷花粉的生活力，即形態(tài)正常的花粉有生活力，而一些小的、皺縮的、畸形的花粉不具有生活力。此法簡便易行但準(zhǔn)確性差，一般只用于測定新鮮花粉的生活力。 3 染色觀察法： 1 ）碘碘化鉀染色法：以碘碘化鉀溶液（ 0.3g 碘 1.3g 碘化鉀溶于 100ml 蒸餾水）染色后于顯微鏡下觀察，花粉被染成藍(lán)色者表示具有生活力，花粉呈黃褐色者不具有生活力。 2 ） TTC 染色法： TTC 染色是一種鑒定去氫酶活性的組織化學(xué)反應(yīng)，凡具有生活力的花粉在其呼吸過程中都有氧化還原作用，當(dāng) TTC 滲入有活力的花粉時，其去氫酶在催化去氫過程中與 TTC

14、結(jié)合，使無色的 TTC 變成 TTF 而呈現(xiàn)紅色。 4 培養(yǎng)基發(fā)芽法 在培養(yǎng)基上進(jìn)行花粉的人工萌發(fā)，鑒定待測花粉萌發(fā)率的高低。此法若采用適宜的培養(yǎng)基能較精確地測定出花粉的生活力，但不同植物的花粉萌發(fā)條件存在較大的差異，所以很多時候測定的結(jié)果也只是相對可靠。 五、實驗步驟： 花粉的貯藏： （）將采集的花粉進(jìn)行干燥（涼干或放入盛有無水氯化鈣的干燥器中干燥），一般以花粉不相互黏結(jié)為度。 （）將干燥的花粉裝在指形管中（不要太多，一般以五分之一體積或更少為宜），瓶口塞以紗布，瓶外貼以標(biāo)簽，注明花粉種類、采收日期。 （）將指形管放入無水氯化鈣控制一定濕度的干燥器中，干燥器置于 0 2 的冰箱內(nèi)。 花粉生活

15、力的測定： （）染色觀察法 TTC 染色法 配制 TTC 染色液：稱取 0.5g TTC 溶于 100ml 磷酸鹽緩沖液（ 100ml 蒸餾水中溶解 0.832g Na2HPO 4 2H2O 和 0.273g KH 2 PO4， pH7.2 ）中，裝入棕色瓶備用。 制片：取少量花粉于載玻片上，滴入 1 2 滴 0.5 TTC 染色液，用鑷子攪拌均勻，蓋上蓋玻片，于 35 40 條件下凈置 15 20min 。 觀察統(tǒng)計：在顯微鏡下觀察三個不同的視野，凡被染成紅色或玫瑰紅的都是有生活力的花粉，黃色或不著色者為沒有生活力的花粉。 （）培養(yǎng)基發(fā)芽法 固體培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基：稱取 1g 瓊脂， 5g

16、蔗糖，量取 94ml 蒸餾水，裝入燒杯，加熱使瓊脂融化呈透明狀（注意補(bǔ)充水分，以保持培養(yǎng)基的濃度），即配成 5% 濃度的培養(yǎng)基。同法配制 10% 、 15% 、 20% 濃度的培養(yǎng)基。 制片：用滴管吸取少量培養(yǎng)基，趁熱滴在載玻片的凹槽內(nèi)，放置片刻，使其凝固。 播種花粉：將少量花粉均勻地撒播在培養(yǎng)基上，注意不可過多，否則難以觀察。 培養(yǎng)與觀察：將制備好的片子放在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，于 20 22 的溫箱中培養(yǎng)；待花粉萌發(fā)后于顯微鏡下觀察并統(tǒng)計發(fā)芽率。觀察時每片隨機(jī)取三個視野，統(tǒng)計花粉總數(shù)及發(fā)芽數(shù)，計算平均萌發(fā)率（花粉總數(shù)不少于 100 粒）。 六、作業(yè)及思考題： 、按下表統(tǒng)計實驗結(jié)果 染色法

17、測定結(jié)果記載表花粉來源各視野中花粉粒數(shù)量及生活力平均生活力()花粉總數(shù)其中花粉總數(shù) 其中 花粉總數(shù) 其中 紅色黃色生活力紅色黃色生活力紅色黃色生活力                            培養(yǎng)基法測定結(jié)果記載表花粉來源培養(yǎng)基濃度各視野中花粉粒數(shù)量及發(fā)芽率平均生活力()123發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)

18、發(fā)芽率發(fā)芽數(shù)/總數(shù)發(fā)芽率                                         、繪一幅花粉粒發(fā)芽形態(tài)圖。 、比較不同方法、不同濃度（培養(yǎng)基法）測得花粉生活力的高低，分析其原因。 實驗四、園林植物開花習(xí)性的觀察與授粉技術(shù)一、實驗?zāi)康?通過對園林

19、植物花器結(jié)構(gòu)及開花授粉習(xí)性的觀察，了解不同園林植物種類的花器官結(jié)構(gòu)特征與開花授粉特點，以及兩者之間的關(guān)系；熟悉園林植物開花習(xí)性調(diào)查的主要觀察項目和觀察方法。 二、實驗材料 懸鈴木、月季、菊花、矮牽牛、石竹、金魚草等園林植物。 三、實驗用具 放大鏡、解剖針、鑷子、剪刀、直尺、記錄板等。 四、實驗原理 不同的園林植物因其自身的發(fā)育特點不同，往往具有不同的花器官結(jié)構(gòu)特征和開花授粉習(xí)性。如有的園林植物為風(fēng)媒花，而有的園林植物則靠蜜蜂、蝴蝶等傳粉媒介進(jìn)行授粉；有的植物花器官結(jié)構(gòu)便于自花授粉，而有的則便于異花授粉。此項觀察可作為識別品種、制定雜交計劃的主要依據(jù)，也可為采留種子，選育不育系等提供理論依據(jù)。

20、五、實驗內(nèi)容 以懸鈴木、月季、菊花、矮牽牛、石竹、金魚草等園林植物為材料，詳細(xì)觀察其花器官的組成與結(jié)構(gòu)特征，了解其開花授粉特點。 1 花器結(jié)構(gòu)的觀察 一般兩性花植物的花朵由花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊等花器官組成，多數(shù)植物的花朵基部還著生有花苞片，而單性花則缺少其中的雄蕊或雌蕊。通過觀察比較，明確不同園林植物的花部構(gòu)造及其形態(tài)特征，了解授粉習(xí)性與其之間的關(guān)系。 2 開花授粉習(xí)性的觀察 1 ）花芽類型：植物花芽的類型基本上可以分為純花芽和混合花芽兩種類型。純花其芽內(nèi)只有花器官，芽 萌發(fā)后，只開花結(jié)果，不抽生枝條，多數(shù)花卉屬于此類； 混合花芽在芽內(nèi)除有花器官外，還存在枝葉或葉的原始體，開花的同時可抽生枝

21、條，如懸鈴木等。 2 ）開花時間及花期長短：不同的園林植物其開花時間差異較大，如梅花、玉蘭、連翹等在早春開花，懸鈴木、牡丹、芍藥等春季開花，荷花夏天開，菊花秋天開，蠟梅則怒放于冬季，而月季、矮牽牛、四季桂等一年四季均能開花。此外，不同品種的始花期、盛花期、終花期及整個開花過程的長短也不相同。通過觀察明確不同植物及品種的花期和開花規(guī)律對于人工雜交具有重要的指導(dǎo)意義。 3 ）花型：包括單瓣、重瓣，大花、小花等?；ㄐ偷谋憩F(xiàn)對于植物的傳粉和結(jié)實會產(chǎn)生影響。 4 ）花性：包括雌雄異株、雌雄同株異花和雌雄同花（兩性花）。有些植物在一個植株上既有兩性花又有單性花；還有些植物盡管具有兩性花，但表現(xiàn)為雄蕊或雌蕊

22、退化。 5 ）花瓣：花瓣的顏色、形態(tài)等表現(xiàn)往往與植物的傳粉方式和授粉習(xí)性有較大的關(guān)系。如開花時花瓣緊閉者（金魚草等）一般采用自花授粉。 6 ）雄蕊和雌蕊：雄性和雌蕊的生長發(fā)育狀態(tài)、著生方式與植物的授粉特點、結(jié)實能力等有很大的關(guān)系。 7 ）花粉：花粉是植物自然授粉和人工雜交的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。同樣的兩性花品種，花藥中產(chǎn)生花粉的多少是不同的，有些很多，有些中等，有些則很少。 六、實驗方法與步驟 1實驗準(zhǔn)備：查閱資料了解所選的實驗材料花器官結(jié)構(gòu)特征和開花授粉習(xí)性的相關(guān)知識。 2分組：每 3 4 人為 1 組，領(lǐng)取實驗工具。3、親本的選擇與選配4、親本植株和花朵的選擇5、去雄、套袋6、花粉采集貯藏7、授粉

23、8、雜交后的養(yǎng)護(hù)管理9、雜種種子的采收七、實驗結(jié)果分析 1、查閱資料了解幾種觀賞植物開花授粉的相關(guān)知識美人蕉花器構(gòu)造：大而鮮紅艷麗部分是5枚特化為花瓣狀的雄蕊，其中一枚反卷稱“唇瓣”。 3枚長卵形的萼片，3枚披針形、狹而尖的花瓣。傳粉介質(zhì)：昆蟲開花習(xí)性：2填寫雜交結(jié)果記載表 雜交組合去雄日期花粉采集日期授粉日期授粉花數(shù)采種日期結(jié)果數(shù)種子數(shù)備注                  3根據(jù)雜交過程中遇到的問題，你認(rèn)為影響雜交結(jié)果的因素有哪些？ 八、作業(yè)及思考題 有性雜交過程中如何解決父母本花期不遇問題？ 紫鴨子

24、草與美人蕉在雜交技術(shù)上有何不同？ 實驗五、人工誘發(fā)植物多倍體一、實驗?zāi)康?了解秋水仙素誘導(dǎo)植物多倍體的原理和鑒定多倍體的依據(jù)；學(xué)習(xí)并掌握植物多倍體誘導(dǎo)與鑒定的方法和技術(shù)。 二、實驗材料 鳳仙花、矮牽牛、懸鈴木等觀賞植物的種子或幼苗。 三、儀器及藥品 儀器：顯微鏡、電子天平、鏡臺測微尺、目鏡測微尺、目鏡測微網(wǎng)、培養(yǎng)箱、鑷子、刀片、游標(biāo)卡尺、鋼卷尺、載玻片、蓋玻片、培養(yǎng)皿、量筒、燒杯、容量瓶、滴管等。 藥品：秋水仙素、酒精、蒸餾水、碘、碘化鉀、對氯二苯、卡諾固定液、卡寶品紅溶液等。 四、實驗原理 目前，人工誘導(dǎo)植物多倍體常用秋水仙素溶液進(jìn)行處理。秋水仙素（ colchicine ）又稱秋水仙堿，是

25、從百合科植物秋水仙中提煉出來的一種植物堿，分子式為 C 22 H 25 O 6 N ，溶于酒精、氯仿和冷水中。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的機(jī)理，在于其抑制細(xì)胞分裂時微管的聚合過程，阻止紡錘絲的形成，使已分裂的染色體不能遷向細(xì)胞的兩極，細(xì)胞中間也不形成新的核膜，從而形成一個核內(nèi)染色體加倍的細(xì)胞；加倍細(xì)胞繼續(xù)分裂便形成多倍體的組織器官，進(jìn)而發(fā)育成為多倍體植株。 隨著植物染色體倍性的變化，其形態(tài)和特性也會發(fā)生相應(yīng)的變化。與二倍體相比，多倍體植株常表現(xiàn)葉片寬厚、表面粗糙、葉柄粗短，莖粗枝少，氣孔數(shù)目減少、保衛(wèi)細(xì)胞變大，葉綠素增加；花、果實、種子等器官較大、花瓣較多、花色濃艷，花粉量減少、花粉粒增大、花粉育性降

26、低，開花和結(jié)實期延遲等。因此，除準(zhǔn)確地進(jìn)行花粉母細(xì)胞或根尖分生組織細(xì)胞的染色體計數(shù)外，也可根據(jù)形態(tài)特征和生長特性對多倍體進(jìn)行間接的鑒定。 五、實驗方法與步驟 1 多倍體的誘導(dǎo) 1 ）秋水仙素溶液的配制： 稱取 1g 秋水仙素粉末，先溶于少量酒精中，然后加冷水定容至 100ml ，配成 1 質(zhì)量濃度的母液，裝于棕色瓶內(nèi)， 1 4 冰箱保存?zhèn)溆?，使用時再稀釋成所需要的濃度。 2 ）秋水仙素處理 ：常用浸漬法、滴液法、涂抹法、注射法、離體法等。可根據(jù)處理的組織器官采用其中的一種。 浸漬法：可浸漬幼苗、新梢、腋芽、插條、接穗、種子等。對種子進(jìn)行處理時，先用清水浸種（發(fā)芽慢的種子應(yīng)催芽），使種子處于萌動

27、狀態(tài)；然后用 0.1% 0.5% 的秋水仙素溶液浸泡種子，一般處理 24h 左右；浸泡后用清水洗凈，略陰干后播種，為了促進(jìn)生根，可在處理液中加入適量的生長素。 滴液法：對幼苗進(jìn)行處理，待子葉展開時，將 0.1% 0.5% 的秋水仙素溶液滴在生長點上，每天早中晚各滴一次，連續(xù)處理 2 3d 。為使藥液不會很快蒸發(fā)，提高處理效果，可在幼苗生長點處放一脫脂棉球，將秋水仙素溶液滴在棉球上。如天氣干燥、蒸發(fā)快，中途可滴加蒸餾水保持藥液濃度；處理結(jié)束后，用清水沖洗數(shù)次，將植株上殘存藥液充分洗凈，注意加強(qiáng)管理，并經(jīng)常觀察記載。 涂抹法：用羊毛脂、瓊脂或甘油將秋水仙素按一定濃度配成乳劑，涂抹在幼苗或枝條的頂端

28、，處理時間 24 48h ；處理部位要適當(dāng)遮蓋，以減少蒸發(fā)和避免雨水淋洗。 注射法：采用微量注射器將一定濃度的秋水仙素溶液注入植株的頂芽或側(cè)芽中。 離體法：在組織培養(yǎng)過程中，將適量的秋水仙素加入培養(yǎng)基，經(jīng)短期培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)入無秋水仙素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，便可獲得多倍體。此法誘變率高，易得到同質(zhì)純合的多倍體。 2 多倍體的鑒定 一般采取先間接鑒定，再直接鑒定的方法。 1 ）間接鑒定法 常采用的鑒定方法有 3 種。 外部形態(tài)鑒定：觀察四倍體與二倍體幼苗，從葉片厚度、顏色深淺、植株生長強(qiáng)弱等方面加以區(qū)別。一般多倍體表現(xiàn)為莖粗壯，葉厚而皺，葉色變深，生長速度減慢，花器變大等。 氣孔鑒定：借助刀片和鑷子撕

29、取一小塊葉片下表皮（應(yīng)呈透明薄膜狀），置于載玻片上，滴一滴蒸餾水或 I 2 -KI 溶液，加上蓋玻片，在顯微鏡下觀察氣孔的密度，并用目鏡測微尺測量氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的長 度 × 寬度 ；統(tǒng)計氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目。測定 50 個氣孔的大小及其保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的數(shù)目，計算平均值。多倍體的氣孔一般比二倍體長，單位面積氣孔數(shù)比二倍體少，保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)葉綠體數(shù)目比二倍體多。 測量氣孔長度的方法：先求目鏡測微尺每小格的長度換算值。在顯微鏡下看準(zhǔn)目鏡測微尺與鏡臺測微尺前后兩個完全重疊的刻度，數(shù)出雙方兩個重疊刻度間所包括的小格數(shù)目，依下式將目鏡測微尺每小格換算為實際長度微米（ ）。 目鏡測微尺每小格長度

30、（ ）鏡臺測微尺小格數(shù)×每小格的長度（ ） / 目鏡測微尺小格數(shù)。 用目鏡測微尺量出氣孔長、寬的格數(shù)，乘以換算值即得實際長度（ ）。當(dāng)變換顯微鏡的目鏡、物鏡的放大倍數(shù)時，須重新調(diào)整換算值；不同的顯微鏡，即使用同樣的放大倍數(shù)觀察，也必須分別測算其換算值，不能彼此代用。 氣孔的密度用目鏡測微網(wǎng)測量，計算單位面積氣孔的數(shù)目。 花粉粒鑒定：將四倍體與二倍體的新鮮花粉撒于載玻片上，于顯微鏡下觀察花粉的形態(tài)和大??；測定 100 個花粉粒的直徑，計算其平均值。多倍體產(chǎn)生的花粉一般比二倍體大。 通過以上間接方法，初步鑒定出多倍體的可能植株，進(jìn)一步進(jìn)行直接鑒定。 2) 直接鑒定法 直接用誘變植株的根尖

31、細(xì)胞或花粉母細(xì)胞制片染色，在顯微鏡下檢測染色體的數(shù)目是否真正加倍。 六、實驗結(jié)果分析 統(tǒng)計不同藥液濃度、不同處理方法及不同處理時間處理后多倍體植株的誘導(dǎo)率。 供試材料藥液濃度處理方法處理時間處理試材數(shù)變異株數(shù)誘變率備注        2觀察變異植株（四倍體）與對照植株（二倍體）的形態(tài)特征，將觀測結(jié)果填入下表： 供試材料染色體數(shù)目葉片形態(tài)氣孔密度氣孔(長×寬)保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)花粉粒直徑備注二倍體（2X）       四倍體（4X）

32、0;      七、作業(yè)及思考題 說明四倍體與二倍體懸鈴木葉片形態(tài)及氣孔的區(qū)別？解釋造成這種不同的原因？ 你認(rèn)為利用秋水仙素誘導(dǎo)多倍體的技術(shù)要點有哪些？ 實驗六、植物培養(yǎng)基的配制與滅菌一、實驗?zāi)康?熟悉植物培養(yǎng)基的基本成分及其作用，掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法及操作要求，掌握培養(yǎng)基與接種用品的滅菌原理及高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。 二、實驗原理 培養(yǎng)基主要為離體培養(yǎng)植物材料的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)劑物質(zhì)，通常分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基兩個水平。前者包括大量元素（無機(jī)營養(yǎng)元素）、微量元素、有機(jī)附加物（維生素、氨基酸等）、糖和水，固體培養(yǎng)基

33、還需加入凝固劑如瓊脂；完全培養(yǎng)基是在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的試驗材料和目的，添加一定濃度的生長調(diào)節(jié)劑如 BA 、 NAA 等以及成分復(fù)雜的有機(jī)附加物如椰子汁、水解酪蛋白等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的 pH 值。不同種植物的離體培養(yǎng)，甚至同種植物不同器官或組織的培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求可能有些不同。園林植物離體培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基主要有 MS 、 N6 、 B5 、 Nitsch 、 White 、 WPM 等。 瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用最廣的凝固劑。加入瓊脂制成的培養(yǎng)基在 98 100 下融化，于 45 以下凝固。但多次反復(fù)融化，其凝固性會降低。 植物培養(yǎng)基含有豐富而全面的

34、營養(yǎng)物質(zhì)，能供養(yǎng)很多細(xì)菌、真菌等微生物的生長。因此，任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成便需及時徹底滅菌，以備培養(yǎng)之用；接種時使用的所有用品如濾紙、水等也要進(jìn)行滅菌。一般采用高壓蒸汽滅菌，于高壓滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行，在 1.1 kg/cm 2 、 121 的條件下消毒 20 25min 。 三、主要儀器及試材 1儀器用具 電子天平、稱量紙、牛角匙、精密 pH 試紙、量筒、燒杯、膠頭滴管、移液管、玻璃棒、培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、封口膜、電爐或微波爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋等。 2藥品試劑 大量元素（NH 4 NO 3 、KNO 3 、MgSO 4 ·7H 2 O、KH 2 PO 4、CaCl 2 ·2H

35、2 O ）、微量元素（KI 、H3 BO 3、MnSO 4 ·4H 2 O 、ZnSO 4 ·7H 2 O 、Na 2 MoO 4 2H 2 O、CuSO 4 5H 2O 、 CoCl 2 ·6H 2 O ）、有機(jī)成分（肌醇、煙酸、鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、甘氨酸）、FeSO 4 ·7H2 O、Na 2 EDTA·2H 2 O、瓊脂、蔗糖、 0.5M NaOH 、BA 、NAA 等。 四、實驗方法與步驟 1培養(yǎng)基母液的配制以 MS 培養(yǎng)基為例 MS 培養(yǎng)基含有近 20 種營養(yǎng)成分，為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對這些成分單獨(dú)進(jìn)行稱量，可將培養(yǎng)基中的各

36、類成分，分別按原用量的 20 倍或 200 倍配成濃縮液，即培養(yǎng)基母液。這樣每次使用時，取其總量的 1/20 （ 50 ml ）或 1/200 （ 5 ml ），便可配成培養(yǎng)液（基）。 1）大量元素母液（ 20 ×）：分別稱取 33g NH 4 NO 3 、38g KNO 3 、7.4g MgSO 4 7H 2 O 和3.4g KH 2 PO4，裝入500ml 燒杯中，加入適量蒸餾水將其充分溶解；另稱取8.8g CaCl 2·2H2O，單獨(dú)溶于 200ml 蒸餾水。然后將二者混合，定容至1 L ，充分混勻后于 4 條件下貯存?zhèn)溆茫ㄏ峦?2）微量元素母液（ 200 

37、15;）：分別稱取 4.46g MnSO 4 ·4H 2 O 、 1.72g ZnSO 4 ·7H 2 O 、 1.24g H 3 BO 3 、166mg KI 、50mg Na 2 MoO 4 ·2H 2 O 、5mg CuSO 4 ·5H 2 O、5mg CoCl 2 ·6H 2 O ，加蒸餾水溶解后，定容至 1L 。 3）有機(jī)成分母液（ 200 ×）：分別稱取 10g 肌醇、 50mg 煙酸、 50mg 鹽酸吡哆醇、 50mg 鹽酸硫胺素、 200mg 甘氨酸，加水溶解后，定容至 500ml 。 4）鐵鹽母液（ 200 

38、5;）：稱取 5.56g FeSO 4 ·7H 2 O 和 7.46g Na 2 EDTA·2H 2 O ，分別溶于 450ml 蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之完全溶解，然后將兩種溶液混合，于 80 水浴中充分熬合（ 30min ），最后定容到 1 L ，保存于棕色容量瓶中。 生長調(diào)節(jié)劑母液：稱取 50mg 或 100mg 植物生長調(diào)節(jié)劑（如 BA 、 NAA 、 IBA 等）粉末，置于 100ml 容量瓶，生長素類先用少量酒精溶解，細(xì)胞分裂素類先用少量 0.5M NaOH 溶解，然后以蒸餾水定容至刻度，即配成 0.5 或 1.0 mg/ml 的母液。 2培養(yǎng)基的配制 以配制

39、 1 L MS BA 1.0mg/L NAA 0.5mg/L 固體培養(yǎng)基為例，基本操作過程如下： 1）稱取 30g 蔗糖和 7g 瓊脂，裝入 1 L 的容器（如燒杯）中，加入約 700ml 蒸餾水，置于帶石棉網(wǎng)的電爐上或微波爐中加熱，并用玻棒攪拌，至瓊脂完全溶化。 2）用量筒或移液管分別取 50ml 大量元素母液、 5ml 微量元素母液、 5ml 有機(jī)成分母液和 5ml 鐵鹽母液，加入上述容器中。 3）分別用 1ml 移液管吸取 1ml BA 母液（ 1.0mg/ml ）和 0.5ml NAA 母液（ 1.0mg/ml ），加入培養(yǎng)基中，然后加蒸餾水將總體積定到 1000ml 。 4）以 0.

40、5M NaOH 溶液將培養(yǎng)基的 pH 調(diào)至 5.8 6.0 ，混勻后分裝于培養(yǎng)容器中，每瓶裝入約 30ml 培養(yǎng)基，然后用聚乙烯膜封口。如果采用培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，配制好的培養(yǎng)基可先裝入三角瓶，滅菌后（培養(yǎng)皿同時滅菌）于超凈工作臺上進(jìn)行分裝。 3滅菌 將培養(yǎng)基、無菌水、濾紙、器皿等放入高壓滅菌鍋內(nèi)，于 1.01kg/cm 2 壓力、 121 條件下滅菌 20min 。滅菌完畢后，將培養(yǎng)基取出（其他滅菌材料一并取出），水平放置于實驗臺上，待其冷卻凝固后便可用于接種培養(yǎng)。 具體操作按滅菌鍋的說明書進(jìn)行，包括加水、裝鍋、蓋蓋、加熱、排放冷空氣、升壓保溫、降壓排氣、出鍋冷卻等步驟。 徹底滅菌后的培養(yǎng)基可于

41、實驗室內(nèi)保存一段時間，但最好盡快使用。 五、實驗注意事項 1配制培養(yǎng)基母液的濃度應(yīng)根據(jù)實際使用情況確定，最好能使母液在 1 2 個月內(nèi)用完，其中有機(jī)成分要在 4 冰箱內(nèi)保存。大量元素母液的配制過程中， CaCl 2 必須單獨(dú)溶解，然后再與其他成分的溶液混合，否則溶液中易出現(xiàn)沉淀；配制鐵鹽母液時，兩種成分應(yīng)單獨(dú)溶解后再于 80 左右充分熬合，避免發(fā)生結(jié)晶沉淀。 2配制培養(yǎng)基的所用器皿和用具均應(yīng)洗滌干凈，培養(yǎng)基的 pH 值應(yīng)調(diào)整準(zhǔn)確，滅菌時間不宜過長，否則培養(yǎng)基可能會出現(xiàn)不凝固現(xiàn)象。 3培養(yǎng)基配制后應(yīng)及時進(jìn)行滅菌，如因特殊情況不能及時滅菌，最好放入冰箱內(nèi)暫存。 4高壓滅菌鍋的使用應(yīng)嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，尤其注意檢查鍋內(nèi)水位，防治干燒導(dǎo)致電熱管損壞。 六、實驗結(jié)果處理 5 6 人為一組，每組按要求配制一種培養(yǎng)基，分裝滅