最全的動物疫病實驗室檢測方法

1、常見疫病實驗室檢測方法最全常見疫病實驗室檢測方法目錄常見疫病實驗室檢測方法 1目錄1常見ELISA操作方法 2亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒2豬瘟抗原檢測試劑盒5豬瘟病毒抗體阻斷ELISA試驗 11豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗13口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測方法（3ABC-I-ELISA） 15口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗 17PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗 21犬細小病毒抗體酶免測定試劑盒說明書23犬瘟熱病毒抗體酶免測定試劑盒說明書25常見PCR操作方法 27豬偽狂犬病毒PCR診斷試劑劑盒 27豬圓環(huán)病毒PCR斷試劑盒 30常見RT-PCR操作方法33口蹄疫病毒分子檢測診斷試劑盒

2、33H5亞型禽流感病毒RT-PCR僉測試劑盒說明書（20次）35新城疫病毒RT-PCR檢測試劑盒37豬瘟病毒RT-PC靜斷試劑盒 40凝集、血凝實驗操作方法 43弓形蟲間接血凝試驗（1HA）試劑使用說明書 43偽狂犬病乳膠凝集試驗試劑盒44豬細小病毒病乳膠凝集試驗LAT診斷試劑盒使用說明書 45豬傳染性萎縮性鼻炎乳膠凝集試驗LAT操作程序46豬瘟正向間接血凝試驗試劑使用說明書及實驗操作程序 47口蹄疫正向間接血凝試驗 50高致病性禽流感血凝（HA和血凝抑制（HI）試驗程序51瓊脂擴散試驗 53雞馬立克氏病 53禽流感瓊脂凝膠免疫擴散試驗55熒光抗體檢測 57豬瘟熒光抗體試驗操作程序57對狂犬病

3、疑似動物腦組織的直接免疫熒光（dFA）檢測58血清學診斷檢測常用試劑配方 60禽流感HA和HI試驗用溶液的配制 60補充實驗63豬流感病毒H1亞型Hl試驗抗原與陰、陽性血清說明書 6366豬流感病毒RT-PCR僉測 豬瘟病毒RT-PC靜斷試劑盒豬繁殖與呼吸綜合癥（Nsp2 15941680變異株）RT-PCR檢測實驗68一、布魯氏菌病試管凝集試驗抗原與陰、陽性血清 71二、布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗72動物結(jié)核病診斷操作規(guī)程7334常見ELISA操作方法試劑盒內(nèi)含物.說明書.96 孔 ELISA 板.液體稀釋槽亞洲1型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒亞洲1型口蹄疫陽性對照血清（己稀釋濃度

4、為1:8）亞洲1型口蹄疫陰性對照血清3%雙氧水.U型96孔抗原抗體反應板.封板膜.滅活亞洲I型口蹄疾病毒抗原.亞洲I型口蹄疫病毒兔抗血清.亞洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清25XPBST洗滌液（稀釋時準確量取） 豚鼠抗血清稀釋液（用冰決包裹）終止液包被緩沖液（碳酸鹽）膠囊底物（檸檬酸-磷酸鹽）緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物OPD片劑二器材準備（需用戶自備）1 .移液器：5- 50 口移液器、0.210 移液器、50200 口移液器、50300科1 12 道移液器各一把。2 .移液槍尖（若干）。3 .抗原抗體反應板：微量血凝板（U型、V型均可）5塊，本試劑盒配備兩塊，用于被 檢血

5、清的稀釋和抗原抗體反應。注：抗原抗體反應板可重復使用，實驗后，用水沖洗干凈，然后用無離子水沸水浴 30秒，晾干，待用。4 .超純水，無離子水或蒸儲水。三、試劑準備（需用戶完成）1 .包被緩沖液（PH9.6）將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開，將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4c存放,1月內(nèi)有效。2 .洗滌液（PBST）將本試劑盒配備的 25倍濃縮PBST液（可能有結(jié)晶形成，用時微熱溶化）用無離子 水或蒸儲水做1:25稀釋。（如果PH降低，務必用NaO戰(zhàn)至7.4）3 .底物溶液取1片檸檬酸一磷酸鹽片劑（本試劑盒配備）溶于100mL無離子水中，溶化后，取50mL 溶液，再加

6、1片鄰苯二胺（OPD）片劑，充分溶解，分裝（5mL/瓶或10Ml/瓶）,避光之- 20c保存。用前避光溶化，臨時每1mL上述溶液加10。本試劑盒配備的 3%的雙氧水（H202）。務必加雙氧水！四、操作步驟1.用包被緩沖液稀釋亞洲 1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（1:1000）, 在ELISA板上每孔加 50 口，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。2.抗原抗體（陰陽性對照血清及待檢血清）反應根據(jù)不同的需要，選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應板上操作。圖1 96孔酶標板檢測10份樣品布局圖S11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32-1:41:161: 641:81:321:

7、1281:641: 2561:1281: 5121:2561:10241:5121:20481:l0241:4096圖1為抗體滴度測定（定量）檢測10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測定（定量）檢 測20份樣品布局圖。圖2 96孔酶標板檢測20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1為例，在U型血凝板上按 50 /孔量用PBST將待檢血清從1:4開始

8、做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時，按圖示稀釋陰陽性對照血清，然后每孔加入 50科1用 PBST稀釋到使用濃度的亞I洲型口蹄疫病毒抗原（1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原對照孔加100 口。振蕩混勻，封板,4 C過夜。加入病毒抗原后血清的稀 釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3.用洗滌液（1 X PBST）洗ELISA板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從 抗原抗體反應板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對應孔，每孔50 口封板,37 C溫育1小時。4 .同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度（1:1000）, 每孔加50 口，封板,

9、37 C溫育1小時。5 .同上洗板5次,甩干。用1XPBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 （1:500）, 每孔加50 口封板,37 C溫育1小時。6 .同上洗板5次，每孔加50 口底物溶液（務必加雙氧水）,37 C溫育15分鐘。每孔再 加50 終止液終止反應，立即在492nm波長下讀取光吸收值（OD92nm彳1）。五結(jié)果判定1 .試驗認可標準每塊板設(shè)4孔病毒抗原對照，病毒抗原對照不加任何血清，直接用PBS而釋至使用 濃度，與血清/病毒抗原復合物同步加入 ELISA板孔,50科1/孔病毒抗原對照 OD492nm值 應在1.5 0.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應在 1:10241滴度以內(nèi)，陰性對

10、照血清抗體效價應V 1:8。2 .病毒抗原對照平均 OD492nm值50%十算（臨界值）抗原對照是4孔，棄去最高和最低 OD492nm1,計算剩余2孔的平均OD492nn，再除以 2,即50%寸照值。該值即為臨界值，表示阻斷50版應的對照OD492nmt。3 .結(jié)果判定以病毒抗原對照平均 OD492nm值白50私臨界值，被檢血清稀釋孔 OD492nm直大于臨 界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的OD492nm直等于臨界值時 所對應的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD492nm直為1.2,則其50%; 0.60。若某一待檢血清在 1:128時OD492nm直

11、為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個滴度之間，如處于1 : 64與1: 128之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中，兩個重復孔只要有一孔為陽性孔，則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽性孔，則判定 為抗體滴度1:128 。ELISA抗體效價1:128,判定為亞洲 1型口蹄疫抗體陽性。ELISA抗體效價與保護力的關(guān)系：牛、羊：抗體效價 1:128,99% 保護；效價w 1:16, 不保護；效價在 1:22-90之間,50%保護。豬瘟抗原檢測試劑盒Classical Swine Fever Virus Antigen Test kit（CSFVAg）概 述

12、豬瘟病毒（CSFV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、邊界病病毒（BDV）都是瘟病毒科黃病毒屬的成員。豬瘟病毒自從成為一種重要的病原體以來，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，并引起豬的嚴重死亡。感染高致病力豬瘟病毒后，豬在出現(xiàn)臨床癥狀前會排出大量的病毒。耐過急性或亞急性感染的動物會產(chǎn)生抗體并且不再散毒。低致病力溫和病毒會造成豬的隱性感染，病豬將會持續(xù)或間歇排出病毒直至死亡。懷孕母豬與豬瘟病毒接觸后可能通過胎盤感染胎兒。先天性感染可能導致流產(chǎn)，木乃伊胎兒，死產(chǎn)和/或弱仔及畸形胎兒。先天性感染低毒力病毒的結(jié)果是產(chǎn)出持續(xù)性感染的仔豬，仔豬出現(xiàn)免疫耐受，不表現(xiàn)任何癥狀向外排毒。豬也有可能感染 BVDV或BD

13、V。盡管這些感染通常呈溫和經(jīng)過并且是自限性的，但將 它們同豬瘟病毒有效區(qū)分是很重要的。原 理本ELISA檢測試劑盒是用來檢測外周血白細胞、全血、細胞培養(yǎng)物以及組織樣本中的豬瘟病毒抗原。采用雙抗體夾心ELISA ,將CSFV單克隆抗血清包被微量反應板，可與樣品中的CSEV抗原結(jié)合。豬瘟病毒的特異性單克隆抗體形成了夾心的上層。形成的單克隆抗體+樣品+單克隆抗體夾心可以用辣根過氧化物酶標記物檢測。加入與辣根過氧化物酶反應的底物，在酶的作用下形成有色產(chǎn)物。通過酶標儀測定其吸光度。可以用450nm單波長或450nm與620m雙波長測定各孔吸光度。試 劑本試劑盒采用96孔板，可以一次檢測 92個樣品（每個

14、樣品1孔，每個對照2孔）或46個樣品（每個樣品2孔，每個對照2孔）；或分6次使用，每次用2個板條，設(shè)2個對照，測定6個樣 品（每個樣品2孔）。為了檢測結(jié)果的準確性，最好每個樣本都設(shè)重復。試劑數(shù)量1、多克隆羊抗血清包被板條8孔X 12條（96孔）2、10倍濃縮樣品稀釋液（10x）55ml足以配制550mL直接使用的1x稀釋液3、10倍濃縮洗滌液（10x）125ml足以配制1、25L直接使用的洗滌液工作濃度 （1x）4、CSFV單克隆抗體，含防腐劑4ml5、陽性對照，含有防腐劑1.5ml6、陰性對照，含有防腐劑1.5ml7、100倍濃縮辣根過氧化物酶標記物 （100x）,辣根過氧化物酶標記抗鼠Ig

15、G ,含有防腐劑200 68、酶標抗體稀釋液15ml9、底物液，TMB/H2O2溶液12ml10、終止液，1M HCI（小心，強酸）12ml注意事項1、仔細閱讀并遵守操作說明；2、試劑盒試劑于27c冷藏保存。建議將濃縮的洗滌液（10x）保存在1825c室溫,以免形成結(jié)晶。3、所有試劑在使用前必須恢復至室溫。4、未使用的包被板應該密封保存在配備的塑料袋中，于27c冷藏保存。5、不要將不同批次的說明書以及試劑盒成分混合使用。6、注意防止真菌或細菌污染試劑盒成分。處理試劑時要小心。7、不要用超過保質(zhì)期的檢測試劑盒。8、進行樣品或試劑操作時嚴禁吃東西、喝水或吸煙。9、每個樣品都用單獨的吸頭。10、每一

16、批次的試劑必須用其配備的陰陽對照。11、配制試劑時只能用超純水。12、不要用嘴吸取液體。13、底物溶液和濃縮的樣本稀釋液對眼睛、呼吸系統(tǒng)和皮膚有剌激性，避免與皮膚和眼睛接觸。14、終止液為1MHC1, HCI為強酸并且能造成灼傷，小心處理。15、本試劑盒只能用于體外診斷。獸醫(yī)專用。 試劑配制1、包被的反應板、豬瘟病毒特異性單克隆抗體、陽性對照、陰性對照、底物溶液、終 止液為現(xiàn)用試劑。2、洗滌液10倍濃縮洗滌液必須用超純水或雙蒸水進行10彳t（1: 10）稀釋，稀釋的洗滌液于 27c冷藏保存，但不能超過 3天；或冰凍保存，至少可以保存一年。例如：配制500ml稀釋的洗滌液，將450ml超純水或雙

17、蒸水加到 50ml濃縮液中，混勻。注意：如果濃縮液有結(jié)晶，在 使用前必須溶解?？蓪⑵孔臃旁跍厮?0分鐘以上。3、樣品稀釋液10倍濃縮樣品稀釋液必須用超純水或雙蒸水進行10倍（1 ： 10）稀釋，但如果檢測全血樣品時，將適量的10倍濃縮液與等體積的超純水混合，制成5倍濃縮液（5X）即可。將制備的稀釋液于27c冷藏保存，但不能超過 3天；或者冰凍保存，可以保存一年以上。4、辣根過氧化物酶標記物 （100x）100彳H（100X）濃縮標記物在使用前必須用標記物稀釋液進行1 ： 100倍稀釋。如果只使用部分試劑，只要用稀釋液按100倍（1 ： 100）稀釋足夠本次使用白標記物濃縮液（旋渦振蕩混勾）即

18、可。稀釋后的標記物溶液只能保存24小時。例如：10ml的辣根過氧化物酶標記物工作液，只需取100 濃縮標記物（100X）加到10ml標記物稀釋液中，在旋渦振蕩器上混勻即可。 自備器材1、精密移液器，5科1至1000 d 12、一次性移液吸頭。3、雙蒸水或超純水。4、洗瓶或自動洗板機。5、濕盒或封板膠帶。6、離心機，2000xg。7、酶標儀。8、離心管和小試管。9、微量離心機，10, 000xg。10、旋渦振蕩器。11、剪刀和攝子。12、0.17MNH 4cI溶液,制備白細胞用。樣品制備注意：制備好的樣品或組織可以在27c保存7天，或-20C冷凍保存6個月以上。但這些樣品在應用前應該再次以 1,

19、 500xg離心10分鐘或10, 000xg離心25分鐘。外周血白細胞a）取10ml肝素或EDTA抗凝血樣品，1, 500xg離心1520分鐘。b）用移液器小心吸出血沉棕黃層，加入 500科樣品稀釋液（1X）,在旋渦振蕩器上混勻，室溫下放置1小時，其間不時用旋渦器混合。然后直接進行步驟f操作；c）假如樣品的棕黃層壓積細胞體積非常少，那么就用整個細胞團（包括紅細胞）。將細胞加進10ml的離心管，并加入5ml預冷（27c ,下同）的0.17MNH 4CI（氯化俊）混勻，靜置10 分鐘。d）用冷（27C）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1, 500xg離心5分鐘。e）棄去上清，向細胞團中

20、加入500科樣品稀釋液（1x）,用潔凈的吸頭懸起細胞，在旋渦振蕩器上混勻，室溫放置1小時。期間不時用旋渦器混合。f） 1, 500xg離心5分鐘，取上清液按操作步驟”進行檢測。g） 注意：處理好的樣品可以在 27c冷藏保存7天，或-20C冷凍保存6個月，但在使 用前必須再次離心。外周血自細胞（簡化方法）a）取0.52ml肝素或EDTA抗凝血與等體積冷（2-8C）0.17M NH4CI加入離心管混合。室 溫放置10分鐘。b） 1, 500xg離心10分鐘（或10, 000xg離心23分鐘），棄掉上清。c）用冷（27C）超純水或雙蒸水加滿離心管，輕輕上下顛倒混勻，1, 500xg離心5分鐘。d）棄

21、去上清，向細胞團中加入500科樣本稀釋液（1x）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置 1小時。期間不時用旋渦器混合。取75科胺照操作步驟”進行檢測。全血（肝素或EDTA抗凝）a）取25 n10倍濃縮樣品稀釋液（10X）和475科隹血加入微量離心管，在旋渦振蕩器上混勻。b）室溫下溫育1小時，期間不時用旋渦器混合。此樣品可以直接按照“操作步驟”進 行檢測?；颍褐苯訉?5科全血加入酶標板孔中，再加入10口5倍濃縮樣品稀釋液（5X）?；蝿用笜税?板條，使樣品混合均勻。再按照“操作步驟”進行檢測。細胞培養(yǎng)物a）移去細胞培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)瓶中的細胞加入到離心管中。b） 2, 500xg離心5分鐘,棄去上清。c）向細

22、胞團中加入500科樣品稀釋液（1x）。旋渦振蕩充分混勻，室溫放置1小時。期間不時用旋渦器混合。取此樣品75 口按照“操作步驟”進行檢測。組織最好用新鮮的組織。如果有必要，組織可以在處理前于28c冷藏保存1個月。每只動物檢測12種組織，最好選取扁桃體、脾、腸、腸系膜淋巴結(jié)或肺。a）取12g組織用剪刀剪成小碎塊（25mm大?。?。b） 將組織碎塊加入10ml離心管，加入5ml樣品稀釋液（1x）,旋渦振蕩混勻，室溫下放 置12小時，期間不時用旋渦器混合。c） 1, 500xg離心10分鐘，取75科比清液按照“操作步驟”進行檢測。 操作步驟注意：所有試劑在使用前應該恢復至室溫1825C;使用前試劑應在室

23、溫條件下至少d） 1小時。1、每孔加入25科1CSFV寺異性單克隆抗體。此步驟可以用多道加樣器（812道）操作。2、在相應孔中分別加入 75科陽性對照、陰性對照，各加 2孔。注意更換吸頭。3、在其余孔中分別加入 75科制備好的樣品，注意更換吸頭。輕輕拍打酶標板，使樣品 混合均勻。4、置濕盒中或用膠條密封后室溫 （1825C）溫育過夜。也可以放置室溫溫育4個小時，但是這可降低檢測靈敏度。5、甩掉孔中液體，用洗滌液（1X）洗滌5次，每次洗滌都要將孔注滿。將孔中的所有液 體倒空，用力拍打酶標板，以使所有液體拍出?；蛘撸靠准尤胂礈煲?250300口用自動 洗板機洗滌5次。注意：洗滌酶標板要仔細細心。

24、6、每孔加入100 d稀釋好的辣根過氧化物酶標記物，在濕盒或密封后置室溫溫育1小時。7、重復操作步驟5;每孔加入100科底物液，在暗處室溫溫育 10分鐘。第1孔加入底物 液開始計時。8、每孔加入100科終止液終止反應。加入終止液的順序與上述加入底物的順序一致。9、在酶標儀上測量樣品與對照孔在450m處的吸光值，或測量在 450nm和620nm雙波長的吸光值（空氣調(diào)零）。10、計算每個樣品和陽性對照孔的矯正吸光值的平均值（參見“計算方法”）。計算方法首先計算樣品和對照孔的 OD平均值，在判定結(jié)果之前，所有樣品和陽性對照孔的OD平均值必須進行矯正，矯正的OD值等于樣本或陽性對照值減去陰性對照值。矯

25、正OD=樣本OD 陰性對照OD注意：北京愛德士元亨生物科技有限公司奮進行平均值相UN值計算并提供數(shù)據(jù)匯總的儀器和軟件系統(tǒng)（xChek）試驗有效性判定陽性對照OD平均值應該大于0.500,陰性對照OD平均值應小于0.150,試驗結(jié)果方能有 效。否則，應仔細檢查實驗操作并進行重測。如果陰性對照的吸收值始終很高，將陰性對 照液在微量離心機中10, 000xg離心35分鐘，重新檢測。結(jié)果判定被檢樣品的矯正吸光值大于或等于0.30,則為陽性：被檢樣品的矯正吸光值小于 0.20,則為陰性；被檢樣品的矯正吸光值大于 0.20,小于0.30,則為可疑。建議根據(jù)外周血白細胞處理方案或細胞培養(yǎng)物處理方案進行全血樣

26、品的處理和檢測。豬瘟病毒抗體阻斷ELISA試驗本方法是用于檢測豬血清或血漿中豬瘟病毒抗體的一種阻斷ELISA方法，通過待測抗體和單克隆抗體與豬瘟病毒抗原的競爭結(jié)合，采用辣根過氧化物酶與底物的顯色程度來進 行判定。1 操作步驟在使用時，所有的試劑盒組分都必須恢復到室溫1825C。使用前應將各組分放置于室溫至少 1小時。1.1 分另將50uL樣品稀釋液加入每個檢測孔和對照孔中。1.2 分另將50uL的陽性對照和陰性對照加入相應的對照孔中，注意不同對照的吸頭要 更換，以防污染。1.3 分另將50uL的被檢樣品加入剩下的檢測孔中，注意不同檢樣的吸頭要分開，以防 污染。1.4 輕彈微量反應板或用振蕩器振

27、蕩，使反應板中的溶液混勻。1.5 將微量反應板用封條封閉置于濕箱中（1825C）孵育2小時，也可以將微量反應板用封條置于濕箱中孵育過夜。1.6 吸出反應孔中的液體，并用稀釋好的洗滌液洗滌3次，注意每次洗滌時都要將洗滌液加滿反應孔。1.7 分另1J將100uL的抗CSFV1標二抗（即取即用）加入反應孔中，用封條封閉反應板 并于室溫下或濕箱中孵育 30分鐘。1.8 洗板（見1.6）后，分別將100uL的底物溶液加入反應孔中，于避光、室溫條件 下放置10分鐘。加完第一孔后即可計時。1.9 在每個反應孔中加入 100uL終止液終止反應。注意要按加酶標二抗的順序加終止 液。1.10 在450nm處測定樣

28、本以及對照的吸光值，也可用雙波長（450nm和620nm）測定樣本以及對照的吸光度值，空氣調(diào)零。1.11 計算樣本和對照的平均吸光度值。計算方法如下：計算被檢樣本的平均值 OD450（= ODTEST、陽性對照的平均值（= ODPOS陰性對照的平均值（= ODNE6根 據(jù)以下公式計算被檢樣本和陽性對照的阻斷率；ODNEG - ODTEST阻斷率= X100%ODNEG2試驗有效性陰性對照的平均 OD450應大于0.50。陽性對照的阻斷率應大于 50% 3結(jié)果判定如果被檢樣本的阻斷率大于或等于40%,該樣本被判定為陽性（有 CSFM體存在）。如果被檢樣本的阻斷率小于或等于30%,該樣本被判定為陰

29、性（無CSFVt體存在）。如果被檢樣本阻斷率在 3040%之間，應在數(shù)日后再對該動物進行重測。豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗（一）材料及試劑1 .豬瘟單抗純化抗原2 .兔抗豬IgG酶標抗體3 .豬瘟陽性血清4 .豬瘟陰性血清14均由指定的生物制品所購買。5 . ELISA反應板6 .包被液碳酸鈉1.50g碳酸氫鈉2.93gH2O加至1 000mlpH值9.67 . PBS 液氯化鈉8.90g、磷酸二氫鉀 0.20g、無水磷酸氫二鈉 2.13g、加雙儲水 1 000ml8 . PBS 吐溫洗滌液、PBS液1 000ml、犢牛血清 5ml、混合即可9 .底物溶液0.1Mol/L檸檬酸液、檸檬酸 21g、

30、雙蒸儲水加至 1 000ml 0.2Mol/L Na2HPO4液、Na2HPO4 122O 71.6g、雙蒸儲水 加至 1 000mlpH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液取液24.30ml、液25.70ml混勻即可鄰苯二胺液取液50ml、雙儲水50ml、磷苯二胺20mg、30%H2O2 0.15mb待鄰苯二胺溶化后 再加H2O2,現(xiàn)用現(xiàn)配。10 .終止液濃 H2SO4（98%） 22.2ml、H2O 177.80ml（二）操作方法1 .用包被液將豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原、豬瘟強毒單抗純化酶聯(lián)抗原各做100倍稀釋，每孔包被100 d l , 4c濕盒過夜。2 .次日取出，甩去孔內(nèi)液體，3X3沖洗。3 .

31、將待檢血清以PBS液彳 400倍稀釋，每孔加100 口同時將豬瘟陽性血清、豬瘟陰性血清各做100倍稀釋，于對照孔中加 100d l。37c溫育1.5h2h。4 .重復第二步，取出，甩去孔內(nèi)液體，3X3洗滌。5 .將兔抗豬IgG酶標抗體以PBS液彳1 100倍稀釋，每孔加100口，37c溫育1.5h 2h。6 .重復第4步。7 .每孔加底物溶液100d l ,室溫下觀察顯色反應。當陰性對照孔稍顯色時，立即終止 反應，并以陰性孔做空白對照。8 .每孔加終止液50 口立即于酶聯(lián)免疫吸附檢測儀測定490nm波長的光密度。（三）結(jié)果判定在豬瘟弱毒酶聯(lián)板上，OA 0.2,為豬瘟弱毒抗體陽性；ODX 0.2

32、,為豬瘟弱毒抗體陰性。在豬瘟強毒酶聯(lián)板上，OA 0.5,為豬瘟強毒抗體陽性；OEX 0.2,為豬瘟強毒抗體陰口蹄疫結(jié)構(gòu)蛋白檢測方法(3ABC-I-ELISA)簡介口蹄疫(FMD)是一種高度接觸性傳染病，傳播迅速，可形成世界性大流行，對養(yǎng)殖業(yè)和國際畜產(chǎn)品貿(mào)易具有嚴重的負面影響。控制和消滅FM睬略包括疫苗免疫和屠宰可疑畜群。在采用疫苗的國家，大多數(shù)動物血清口蹄疫病毒(FMDV用構(gòu)蛋白和病毒感染相關(guān)抗原(VIAA,即3D)抗體均為陽性，因此，一些基于結(jié)構(gòu)蛋白和VIAA的診斷方法很難確定口問疫病毒感染與否。只有將感染動物和隱性帶毒動物與疫苗免疫動物加以區(qū) 分才能為FMD勺控制和消滅提供科學的依據(jù)。日前

33、的疫苗生產(chǎn)工藝，在病毒純化過程中 去除絕大部分非結(jié)構(gòu)蛋白，因此滅活疫苗免疫動物體內(nèi)沒有病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體產(chǎn)生，而自然感染動物體內(nèi)既有結(jié)構(gòu)蛋白抗體，也有非結(jié)構(gòu)蛋向3AB%體。因此檢測FMDVjE結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體的ELISA方法不但可以檢測隱性感染動物，而且可以區(qū)分感染 動物和免疫動物?？谔阋卟《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白抗體檢測試劑盒(FMD3ABC-I-EL1SA)對感染牛的檢出率很高，敏感性在99艱上。對免疫牛的特異性在 96%A上。用途FMD3ABC-I-ELISA試劑盒檢測FMDVfE結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體。該試劑盒不受血清型影響， 適用于活畜進出口調(diào)運、疫區(qū)凈化檢疫和群體無癥狀感染評價，區(qū)分

34、感染和免疫動物。原理FMD3ABC-I-ELISA試劑盒采用間接 ELISA模式。用3ABCg因表達蛋白（Ag）包被ELISA板，洗板封閉。檢測時，加入待檢血清樣品，如果血清樣品中有3AB%體，與ELISA板上3ABC蛋白結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，再與酶標二抗結(jié)合，加入底物后，就會出現(xiàn)顏色反應。如果待檢樣品為陰性，就不能形成抗原-抗體復合物，酶標二抗不會結(jié)合，因此就不顯色。注意事項1 .冰凍血清樣品應充分融化，且應混和均勻。2 .血清稀釋液和底物應平衡至室溫應用。底物A在4c為結(jié)晶狀態(tài)，需要在室溫或37 c水浴化開后應用。3 .最好在血清稀釋板上稀釋血清，以減小操作誤差。4 .應使用相同的加

35、樣器加樣，以保證加樣量的準確，減小試驗誤差。5 .多道微量移液器所用的吸頭應為同一規(guī)格和型號，避免加樣誤差。6 .應使用自動或手動連續(xù)洗板系統(tǒng)洗板。7 .加樣先后次序應該一致，保證作用時間一樣。8 .底物作用時間到后，如果顏色較淺，可適當延長作用時間。9 .本試劑盒只能檢測一種動物的血清樣本，應分別訂購檢測牛、豬或羊血清的試劑 盒，以測定不同動物來源的血清。試劑準備1.洗滌液（PBST）將試劑盒配備的25倍濃縮PBST用無離子水或蒸儲水做1:25倍稀釋即可。操作步驟1 .待檢血清樣品和陽性、陰性對照血清用血清稀釋液1:21倍稀釋（120血清稀釋液加血清6L）,每孔加入lOOp L,陰、陽性對照

36、血清平行加兩孔，用封口膜封口，37 c結(jié)合30分鐘。2 .取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。3 .用血清稀釋液按l:lOO比例稀釋酶標二抗，每孔加入100 L,用封口膜封口，37 c結(jié)合30分鐘。4 .取掉封口膜，每孔加滿洗滌液，洗滌 5次，最后一次拍干。5 .將底物A按1:50比例（體積比）稀釋于底物B中（lmL底物B中加入20dL底物A）,吹打 混勻，每孔加入100d L,封口膜封口，37c避光作用 1015分鐘。6 .每孔加入.1001終止液。7 .輕輕搖振混勻，測定波長 450nm吸光值（OD450nm直）。8 .陽性對照平均OD值應大于0.6 ;陰性對照平均 OD

37、直應小于0.2。9 .結(jié)果計算：樣品效價為:（OD樣品-OD陰性）+ （OD陽性-OD陰性）。結(jié)果判定若效價0.2,為陰性；效價在 0.20.3之間為可疑；效價0.3為陽性。可疑和陽性 樣品應進行復測，復測為可疑或者陽性時，應判為陽性。96孔酹機板你局圖ARCD E F G,性_ 11國出匚_ 1 I HittT . J對性J_1L L一一 11 ,ir口蹄疫抗體液相阻斷-酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒內(nèi)含物.說明書.96 孔 ELISA 板.液體稀釋槽亞洲1型口蹄疫陽性對照血清（己稀釋濃度為1:8）亞洲1型口蹄疫陰性對照血清3%雙氧水.U型96孔抗原抗體反應板25XPBST洗滌液（稀釋時準確量取）.

38、封板膜豚鼠抗血清稀釋液.滅活亞洲I型口蹄疾病毒抗原（用冰決包裹）終止液.亞洲I型口蹄疫病毒兔抗血清包被緩沖液（碳酸鹽）膠囊.亞洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清底物（檸檬酸-磷酸鹽）緩沖液片劑.兔抗豚鼠血清IgG-辣根過氧化物酶結(jié)合物OPD片劑器材準備（需用戶自備）1 .移液器：5- 50 口移液器、0.210 移液器、50200 口移液器、50300科1 12道移液器各一把。2 .移液槍尖（若干）。3 .抗原抗體反應板：微量血凝板（U型、V型均可）5塊，本試劑盒配備兩塊，用于被 檢血清的稀釋和抗原抗體反應。注：抗原抗體反應板可重復使用，實驗后，用水沖洗干凈，然后用無離子水沸水浴 30秒，晾干，待用。

39、4 .超純水,無離子水或蒸儲水。三、試劑準備（需用戶完成）1 .包被緩沖液（PH9.6）將本試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開，將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4c存放,1月內(nèi)有效。2 .洗滌液（PBST）將本試劑盒配備的 25倍濃縮PBST液（可能有結(jié)晶形成，用時微熱溶化）用無離子 水或蒸儲水做1:25稀釋。（如果PH降低，務必用NaOH至7.4）3 .底物溶液取1片檸檬酸一磷酸鹽片劑（本試劑盒配備）溶于100mL無離子水中，溶化后，取50mL 溶液，再加1片鄰苯二胺（OPD）片劑，充分溶解，分裝（5mL/瓶或10Ml/瓶），避光之- 20c保存。用前避光溶化，臨時每1m

40、L上述溶液加10。本試劑盒配備的 3%的雙氧水（H202）。務必加雙氧水。四、操作步驟1 .用包被緩沖液稀釋亞洲 1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃度（1:1000）, 在ELISA板上每孔加 50 口，振蕩，封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。2 .抗原抗體（陰陽性對照血清及待檢血清）反應根據(jù)不同的需要，選擇圖1-2中的一種布局在抗原抗體反應板上操作。圖1 96孔酶標板檢測 10份樣品布局圖S11:8S2S3S4S5S6S7S8S9S10+ 1:32-1:41:161: 641:81:321: 1281:641: 2561:1281: 5121:2561:10241:5121:20481:l0241:40

41、96圖1為抗體滴度測定（定量）檢測10份樣品布局圖；圖2為抗體滴度測定（定量）檢 測20份樣品布局圖。圖2 96孔酶標板檢測 20份樣品布局圖S11:32S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1:32-1:41:641:641:81:1281:1281:2561:256S111:32S12S13S14S15S16S17S18S19S201:5121:641:10241:1281:20481:2561:4096以圖1為例，在U型血凝板上按 50 /孔量用PBST將待檢血清從1:4開始 做2倍連續(xù)稀釋至 1:512。同時，按圖示稀釋陰陽性對照血清，然后每孔加入 50科1用 PBST稀釋到使用濃度

42、的亞I洲型口蹄疫病毒抗原（1:4,即1份病毒抗原、加3份PBST）,病毒抗原對照孔加100 口。振蕩混勻，封板,4 C過夜。加入病毒抗原后血清的稀 釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋。3 .用洗滌液（1 X PBST）洗ELISA板5次，在洗水紙上甩干，再將抗原抗體混合物從 抗原抗體反應板上按次序轉(zhuǎn)移至ELISA板上的相對應孔，每孔50 口封板,37 C溫育1小時。4 .同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀釋液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作濃度（1:1000）, 每孔加50 口，封板,37 C溫育1小時。5 .同上洗板5次,甩干。用1XPBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度 （1:500）,

43、 每孔加50 口封板,37 C溫育1小時。6 .同上洗板5次，每孔加50 口底物溶液（務必加雙氧水）,37 C溫育15分鐘。每孔再 加50 終止液終止反應，立即在492nm波長下讀取光吸收值（OD492nm值）。五結(jié)果判定1 .試驗認可標準每塊板設(shè)4孔病毒抗原對照，病毒抗原對照不加任何血清，直接用PBS而釋至使用 濃度，與血清/病毒抗原復合物同步加入 ELISA板孔,50科1/孔病毒抗原對照 OD492nm值 應在1.5 0.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應在 1:10241滴度以內(nèi)，陰性對照血清抗體效價應V 1:8。2 .病毒抗原對照平均 OD492nm值50%十算（臨界值）抗原對照是4孔，棄去

44、最高和最低 OD492nm1,計算剩余2孔的平均OD492nn，再除以 2,即50%寸照值。該值即為臨界值，表示阻斷50版應的對照OD492nmt。3 .結(jié)果判定以病毒抗原對照平均 OD492nm值白50私臨界值，被檢血清稀釋孔 OD492nm直大于臨 界值的孔為陰性孔，小于或等于臨界值的孔為陽性孔，陽性孔的OD492nm直等于臨界值時 所對應的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD492nm直為1.2,則其50%; 0.60。若某一待檢血清在 1:128時OD492nm直為0.6,則該份待檢血清的抗體滴度為 1:128 。若臨界值處于兩個滴度之間，如處于1 : 64與1: 12

45、8之間，則抗體滴度取中間值為1:9O。定性檢測中，兩個重復孔只要有一孔為陽性孔，則抗體滴度判定為1:128,兩孔均為陽性孔，則判定 為抗體滴度1:128 。ELISA抗體效價1:128,判定為亞洲 1型口蹄疫抗體陽性。ELISA抗體效價與保護力的關(guān)系：牛、羊：抗體效價 1:128,99% 保護；效價w 1:16, 不保護；效價在 1:22-90之間,50%保護。PRRS抗體間接酶聯(lián)免疫吸附試驗1、試劑的準備所有的試劑在使用前，必須回溫到室溫。洗液（10x）: 1份清洗液加入到9份滅菌水或去離子水中，7天內(nèi)用完。清洗液使用前搖勻溶解。樣本稀釋液（3x）:1體積的樣稀釋液中加入 2體積的蒸儲水或去

46、離子水， 2天內(nèi)用完。2、樣本的準備陽性對照，陰性對照不必稀釋，樣本用樣本稀釋液200倍稀釋，稀釋方法：取 5 口的樣本加入95 口的樣本稀釋液，再取稀釋了20倍的液體5 口加入到ELISA反應孔中，再加入45 dl的樣本稀釋液。3、操作步驟將樣本和對照加入到板孔中。陽性對照和陰性對照必須是雙份。1 .加入50 口陽性和陰性對照，及 200倍稀釋的樣品在反應板孔。2 .蓋上膜，在37c作用60分鐘。3 .去膜，用300口的洗液洗3遍，并在吸水紙上將平板弄干（顛倒，在紙上輕敲）4 .在每個空中加入50 口的酶標抗體。5 .蓋上膜在37c作用60分鐘。6 .去膜，用300dl的洗液洗3遍，弄干。7

47、 .加入50 口的底物，輕搖板2次。8 .將平板放在黑暗中在 20-25C作用10分鐘。9 .加入50 口終止液，輕敲平板混勻。10 .用柔軟的東西輕拭平板上的贓物，在450nm下讀數(shù)并記錄結(jié)果。讀數(shù)A.實驗成立條件陽性對照的平均值 OD4500.6,而且陽性對照平均值/陰性對照平均值4.0.B.結(jié)果的稀釋結(jié)果用IRPC表示，以下是計算公式（OD 450樣品-OD450陰性對照平均值）IRPC = X100ODNEGIRPCPRR凱體說明小于或者等于20.0陰性大于20.0陽性犬細小病毒抗體酶免測定試劑盒說明書原理：本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測犬血清中犬細小病毒IgG抗體。在聚苯乙烯微

48、孔酶標板上，包被純化的犬細小病毒抗原。待檢血清中的CPM體與包被抗原特異結(jié)合，再與HR刖記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合，形成抗原抗體酶標抗體復合物,加TM歌物作用顯色，在酶標儀上測定OD直判定結(jié)果。試劑盒的組成（96頭份）：1. CPM原反應板12*8孔2. 20倍濃縮洗液30m1*1瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CPVW生對照300 d L*1 支5、CPVW生對照300 d L*1 支6、50倍CPV!結(jié)合物液300科L*l支7、酶結(jié)合物稀釋液15m1*1瓶8、底物液 A8m1*1瓶9.底物液B8m1*1瓶10、終止液8m1*1瓶11、封板膜2張12、自封袋1個13、說明書1張試劑準備：1

49、.將20倍濃縮洗液用蒸儲水稀釋 20倍后備用（30ml濃縮洗液+570m1蒸儲水）。2 .將50倍CPV1結(jié)合物液用酶結(jié)合物稀釋液稀釋50倍后備用（300u1 50倍CPV1結(jié)合物液+15m1酶結(jié)合物稀釋液），輕振混勻，當日用完。操作步驟：1 .待檢血清在板孔外用稀釋后的洗滌液作1:16倍預稀釋（150uL洗滌液+10uL待檢血清）備用。陰、陽性對照不稀釋。2 .記下稀釋樣品的對應編號，每次試驗設(shè)陽性對照、陰性對照、各 2孔。3 .試劑盒平衡至室溫，在反應板各孔中加入 100uL樣品稀釋液。再分別在相應孔中加 入經(jīng)預稀釋的待檢血清 1OuL,然后在對照孔中分別加入10uL陰、陽性對照。充分混勻

50、后，貼上封板膜，置37c溫育20分鐘。4 .小心揭掉封板膜，棄去各孔中液體、拍干。每孔加滿洗滌液，靜置約30秒，如此重復洗滌5次，最后一遍拍干。5 .每孔加入經(jīng)過稀釋的酶結(jié)合物液100uL,貼上封板膜，置37c溫育20分鐘。6 .操作同步驟5。7 .每孔加入底物液 A50uL,再加入底物液B 50uL,輕拍?！勻，置37c避光顯色10分鐘。8 .每孔加入終止液50uL,輕輕振蕩，置酶標儀450nm波長處測定 OD直。要求：1 .陽性對照OD值有效范圍：0.60o2 .陰性對照OD值有效范圍：w 0.10（陰性對照若有一孔大于0.10應舍棄，如果兩孔OD值都大于0.10,應重復試驗）。結(jié)果判定：

51、1 .臨界值（Cut Off值）的計算：Cut Off值=（陽性對照OW均值一陰性對照 OD平均值）X0.1+陰性對照 OW均值2 .待檢樣本OD值臨界值（Cut Off值）即判為CPM體具有彳護效價：小于臨界值（Cut Off值）即判為CPM體未達到保護效價。注意事項：1 .試劑盒從冷藏環(huán)境中取出時應置室溫平衡后再打開密封袋，未用完的微孔反應板條用自封袋加干燥劑保存。2 .各步加液均應使用加液器并經(jīng)常校對其準確性，以減少實驗誤差。3 .洗滌時各孔均需加滿洗滌液，防止因洗滌不充分造成非特異性顯色。4 .封板膜只限一次使用，以避免交叉污染。5 .結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，且終止反應后應在10

52、分鐘以內(nèi)測定其 OD直。6 .所有樣品、洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。7 .不同批次試劑不能混用。8 .請嚴格按說明書操作。犬瘟熱病毒抗體酶免測定試劑盒說明書原理本試劑盒采用間接 ELISA方法檢測犬血清中犬瘟熱病毒IgG抗體。在聚苯乙烯微孔酶標板上，包被純化的犬瘟熱病毒抗原。待檢血清中的CDVt體與包被抗原特異結(jié)合，再與HR刖記的兔抗犬IgG抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標抗體復合物，加TM聰物作用顯色，在酶標儀上測定 OD直判定結(jié)果。試劑盒的組成（96頭份）：1、CDM原反應板2、20倍濃縮洗液12*8 孔30ml*1 瓶3、樣品稀釋液15mI*1瓶4、CDVM性對照300 d L*1 支5、CDV印日性對照300 d L*1支6、50倍CDV1結(jié)合物液300科L*l支7、酶結(jié)合物稀釋液15m1*1瓶8、底物液 A8m1*1瓶9.底物液B8m1*1瓶10、終止液8m1*1瓶