五種玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對髓核細胞的毒性分析

1、 CRTER.org李建國，等. 五種玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對髓核細胞的毒性分析五種玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對髓核細胞的毒性分析李建國1，李 盼2，3，4，尹合勇3，5，劉 曦2，周玉軍2，李海濤2，李彥飛2，王 飛2，胡成棟2(1邯鄲市涉縣醫(yī)院急診科，河北省邯鄲市 056400；2邯鄲市中心醫(yī)院骨二科，河北省邯鄲市 056001；3解放軍總醫(yī)院骨科研究所，北京市 100039；4河北醫(yī)科大學(xué)，河北省石家莊市 050011；5南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津市 300073)引用本文：李建國，李盼，尹合勇，劉曦，周玉軍，李海濤，李彥飛，王飛，胡成棟. 五種玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對髓核細胞的

2、毒性分析J.中國組織工程研究，2021，20(11):1570-1576.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2021.11.008 ORCID: 0000-0001-6164-7359(胡成棟)文章快速閱讀：分析玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對兔髓核細胞的毒性作用李建國，男，1971年生，河北省涉縣人，漢族，2005年河北醫(yī)科大學(xué)畢業(yè)，主治醫(yī)師，主要從事脊柱相關(guān)疾病與急救醫(yī)學(xué)研究。通訊 胡成棟，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，邯鄲市中心醫(yī)院骨二科，河北省邯鄲市 056001 中圖分類號:R318文獻標(biāo)識碼:B文章編號:2095-4344(2021)11-01570-07稿件

3、接受：2015-12-28 :/ 實驗旨在分析不同玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對于兔髓核細胞的毒性作用，從而為玻璃化凍存椎間盤選擇適宜的凍存試劑主要觀察指標(biāo)(1)5種單一凍存試劑處理髓核細胞的FDA/PI染色結(jié)果分析(2)不同組合玻璃化凍存試劑處理髓核細胞后的FDA/PI染色細胞存活率分析(3)不同組合玻璃化凍存試劑處理髓核細胞后的CCK-8細胞活性檢測結(jié)果分析結(jié)果分析：5種二甲基亞砜甲酰胺乙二醇丙二醇丙三醇選取常用的玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用：采用單一、任意2種及任意3種玻璃化凍存試劑互相組合成25種凍存試劑組合 文題釋義：玻璃化凍存方法：采用高濃度凍存溶液單步驟快速降溫

4、，溶液逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴Ａ訜o定形體，組織在保存過程中細胞內(nèi)外不形成冰晶，可防止細胞結(jié)構(gòu)的破壞，有效保存細胞的活性。髓核：髓核為椎間盤結(jié)構(gòu)的一局部，位于兩軟骨板與纖維環(huán)之間，是乳白色半透明膠狀體，富于彈性，由縱橫交錯的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即軟骨細胞和蛋白多糖黏液樣基質(zhì)構(gòu)成的彈性膠凍物質(zhì)。摘要背景：凍存椎間盤可為同種異體椎間盤移植創(chuàng)造條件，傳統(tǒng)的低溫冷凍法常導(dǎo)致細胞內(nèi)外冰晶形成從而造成細胞損傷，玻璃化凍存法可防止凍存過程中細胞內(nèi)外形成冰晶而得到廣泛應(yīng)用，然而玻璃化法凍存椎間盤在內(nèi)外文獻中卻少見報道，凍存試劑對髓核細胞的毒性研究也比擬少見。目的：分析5種玻璃化凍存試劑單獨或組合應(yīng)用對于兔髓核細胞的毒性作用，從而

5、為玻璃化凍存椎間盤選擇適宜的凍存試劑。方法：選取目前最常用的5種玻璃化凍存試劑：二甲基亞砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，采用單一5種、任意2種及任意3種玻璃化凍存試劑互相組合成各10種凍存試劑組合共25種。用CCK-8和FDA/PI兩種方法檢測髓核細胞的細胞存活率。用統(tǒng)計學(xué)方法對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，選出對髓核細胞毒性較小的玻璃化凍存試劑組合方案。結(jié)果與結(jié)論：兩種檢測方法檢測結(jié)果：5種玻璃化試劑對髓核細胞的毒性由小到大依次為：乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。2種凍存試劑組合和3種凍存試劑組合的毒性均比組成該組合溶液的任意一種單一玻璃化凍存試劑小。組合試劑中，含有乙二醇或丙三醇的

6、2種凍存試劑組合或3種凍存試劑組合毒性均較小。故玻璃化凍存椎間盤可選用包含乙二醇和(或)丙三醇的玻璃化組合試劑。關(guān)鍵詞：組織構(gòu)建；組織工程；玻璃化；毒性；凍存試劑；椎間盤；髓核細胞；存活率主題詞：椎間盤；存活率；藥物毒性基金資助：邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與開展方案工程(0928108052)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083sina Five kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or combination to nucleus pulposus cellsLi Jia

7、n-guo1, Li Pan2, 3, 4, Yin He-yong3, 5, Liu Xi2, Zhou Yu-jun2, Li Hai-tao2, Li Yan-fei2, Wang Fei2, Hu Cheng-dong2 (1Emergency Department, Shexian County Hospital, Handan 056400, Hebei Province, China; 2Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, China;

8、3Institute of Orthopedics, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100039, China; 4Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 5School of Medicine, Nankai University, Tianjin 300073, China)AbstractBACKGROUND: Transplantation of allogeneic intervertebral disc can be facilitate

9、d by the cryopreservation of the intervertebral disc. But the traditional cryopreservation methods always lead to the appearing of ice crystals inside and outside the cells which can cause cellular injury. The vitrification method that can avoid the formation of ice crystals have been widely applied

10、 in the cryopreservation field. However, only a few reports have assessed the vitrified cryopreservation of the intervertebral disc, and the toxicity of cryoprotectants to the nucleus pulposus cells have not been fully explored.OBJECTIVE: To determine the order of toxicity of five commonly used cryo

11、protectants that are used alone or in combination to rabbit nucleus pulposus cells, and to select the optimal cryoprotectant for the vitrification of the intervertebral disc.METHODS: We chose five most commonly used cryoprotectants including dimethyl sulphoxide, formamide, ethylene glycol, propylene

12、 glycol and glycerol. Then, 5 single commonly used cryoprotectants, 10 mixed agents containing any 2 commonly used cryoprotectants, and 10 mixed agents containing any 3 commonly used cryoprotectants were formulated. Cell viability of nucleus pulposus cells was determined using cell counting kit-8 an

13、d fluorescein diacetate/propidium iodide method. All data obtained were analyzed statistically to choose the appropriate combining scheme with less toxicity.RESULTS AND CONCLUSION: The order of the toxicity of these five commonly used cryoprotectants from low to high was ethylene glycol, glycerol, f

14、ormamide, dimethyl sulphoxide, and propylene glycol. The toxicity of the combined agents containing two or three commonly used cryoprotectants was lower than that of any commonly used cryoprotectants that were used to formulate them. The toxicity of the mixed agents that contained ethylene glycol or

15、 glycerol was lower than that of any other mixed agents. So we can choose the mixed cryoprotectants that contain ethylene glycol and (or) glycerol for the vitrification of the intervertebral disc.Subject headings: Intervertebral Disk; Survival Rate; Drug ToxicityFunding: Handan Science and Technolog

16、y Research and Development Project, No. 0928108052Cite this article: Li JG, Li P, Yin HY, Liu X, Zhou YJ, Li HT, Li YF, Wang F, Hu CD. Five kinds of vitrified cryoprotectants: toxicity of their alone or combination to nucleus pulposus cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2021;20(11):1570-1576.Li

17、Jian-guo, Attending physician, Emergency Department, Shexian County Hospital, Handan 056400, Hebei Province, ChinaCorresponding author: Hu Cheng-dong, M.D., Chief physician, Masters supervisor, Second Department of Orthopedics, Handan Central Hospital, Handan 056001, Hebei Province, China1573ISSN 20

18、95-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction目前，在器官移植、人工授精、病毒研究等領(lǐng)域中，凍存細胞、組織或器官是一項非常重要的根本技術(shù)1。臨床和科研中最常用的凍存方法有慢速冷凍保存法和玻璃化凍存法2，玻璃化凍存法是指采用高濃度凍存液單步驟快速降溫，使凍存液直接進入玻璃態(tài)，從而防止凍存過程中產(chǎn)生冰晶損傷細胞。而慢速冷凍法采用分步降溫，操作復(fù)雜，且凍存過程中產(chǎn)生冰晶較多，容易損傷細胞。玻璃化凍存法相對于慢速冷凍法是一個新穎、操作簡單、本錢低廉的方法3。目前玻璃化凍存法已成功應(yīng)用于凍存精子4、卵母細胞5、胚胎6、軟骨7、心臟瓣膜8、腎臟等多種

19、細胞和組織9，但對于其應(yīng)用于凍存椎間盤，以及玻璃化凍存試劑對于髓核細胞的毒性在國內(nèi)外的相關(guān)報道甚少，此次實驗的目的是檢測目前最常用的5種凍存試劑及其組合試劑對兔髓核細胞的毒性，從而為玻璃化凍存椎間盤選擇最正確的凍存試劑。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計 試劑配制，細胞實驗，毒性檢測。1.2 時間及地點 實驗于2021年3月至9月在解放軍總醫(yī)院骨科研究所完成。1.3 材料1.3.1 實驗動物 8周齡健康雄性新西蘭大白兔10只，由解放軍總醫(yī)院動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：scxk(京)2021-0001。1.3.2 主要試劑和儀器 試劑及儀器來源二甲基亞砜

20、(DMSO)、甲酰胺(Formamide)、乙二醇(Ethylene Glycol)、丙二醇(Propylene Glycol)、丙三醇(Glycerol)北京化學(xué)試劑，中國磷酸鹽緩沖液(PBS)Solarbio 公司，中國100青霉素/鏈霉素雙抗溶液Hyclone公司，美國DMEM/F-12 細胞培養(yǎng)基康寧公司，美國胎牛血清(FBS)杭州四季青生物工程，中國FDA/PISigma公司，美國Cell Count Kit-8試劑盒同仁化工，日本Image Pro Plus 圖像分析軟件Media Cybernetics 公司，美國BX51 型顯微鏡Olympus 公司，日本酶標(biāo)儀美谷分子儀器，美

21、國生物凈化臺SW-CJ-1F蘇州凈化設(shè)備，中國colorsquid磁力攪拌器IKA 公司，德國CO2恒溫培養(yǎng)箱B5060型Hereus 公司，德國1.4 實驗方法 1.4.1 取材 給予新西蘭大白兔肌注0.5%戊巴比妥鈉(0.1 mg/kg)處死，取材需在處死后30 min內(nèi)完成。后背部手術(shù)區(qū)域剃毛備皮，常規(guī)消毒、鋪單，沿后背部正中切口縱行切開皮膚、深筋膜、肌肉，別離椎旁肌，用組織鉗提起脊柱后別離椎體前肌肉，切斷肋骨及局部橫突，取下胸段及腰段脊柱，生理鹽水沖洗3遍后迅速移至超凈試驗臺。用尖刀劃開胸1椎間盤前方纖維環(huán)，彎折相鄰椎體顯露間隙后可見椎間盤中膠凍狀髓核附著于纖維環(huán)上，用眼科鑷將髓核組織

22、移至盛有DMEM-F-12培養(yǎng)皿中，其余節(jié)段髓核組織依次取出。1.4.2 細胞培養(yǎng) 用DMEM-F-12培養(yǎng)液將髓核組織涮洗2遍后用眼科鑷移至盛有0.2%型膠原酶的安瓿瓶中，眼科剪剪碎髓核組織成1 mm 1 mm 1 mm的組織塊，放入無菌磁力轉(zhuǎn)子在37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中攪拌消化40 min。將消化成的混懸液移至離心管中，1 700 r/min離心5 min，棄上清液，參加0.25%胰蛋白酶，將混懸液移至安瓿瓶中再次放入37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中攪拌消化20 min，參加適量含體積分?jǐn)?shù)10%血清的DMEM-F-12培養(yǎng)液停止消化，離心棄上清液后接種于培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)液為含

23、體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 mg/L鏈霉素的DMEM-F-12)，3 d后第1次換液，可觀察到少量細胞貼壁，此后每天觀察生長狀態(tài)，每2 d換1次液，15 d后待細胞貼壁率約為80%時傳代。選取第2代生長狀態(tài)良好的髓核細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細胞，向96孔板實驗組各孔中參加100 L細胞懸液(10 000細胞)，放入37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。1.4.3 玻璃化試劑的配制 選取目前最常用的5種凍存試劑：二甲基亞砜、甲酰胺、乙二醇、丙二醇、丙三醇，任意2種玻璃化凍存試劑組合成10組2-CPA，任意3種CPA組合成10組3-CPA(表1)。選擇玻璃

24、化凍存組織和細胞所需要的玻璃化凍存試劑濃度(約8 mol/L)，2-CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為11，3-CPA中玻璃化凍存試劑濃度比例為111。表1 玻璃化凍存試劑組合方案Table 1 The combination of the cryoprotectant agents玻璃化凍存試劑組合方案單一凍存試劑D，G，P，E，F(xiàn)2種凍存試劑組合(2-CPA)D+F，D+E，D+P，D+G，G+P，G+E，G+F，P+E，P+F，E+F3種凍存試劑組合(3-CPA)D+F+E，D+F+P，D+F+G，D+E+P，D+E+G，D+P+G，G+P+E，G+P+F，G+E+F，P+E+F表注：D：

25、二甲基亞砜；G：丙三醇；P：丙二醇；E：乙二醇；F：甲酰胺。1.4.4 玻璃化凍存試劑階梯式參加及移出方法 96孔板中細胞貼壁并培養(yǎng)48 h后對其進行換液，用移液管將各孔的培養(yǎng)液緩慢吸出后注入100 L DMEM-F-12。為防止參加過高濃度玻璃化凍存試劑對細胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采取階梯式參加方法。為緩慢到達8 mol/L的濃度，首先吸出50 L培養(yǎng)液，參加8 mol/L 的玻璃化凍存試劑50 L，得到4 mol/L的溶液。5 min后第2次吸出50 L液體，參加8 mol/L的玻璃化凍存試劑50 L，得到6 mol/L的溶液。5 min后第3次吸出50 L液體，參加10 mol/L的玻璃化

26、凍存試劑50 L，最終得到濃度為 8 mol/L的溶液。之后，將96孔板放置于37 ，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中15 min。同樣為防止移出玻璃化凍存試劑對細胞滲透壓產(chǎn)生較大影響，采用階梯式緩慢移出的方法。為緩慢移出8 mol/L玻璃化凍存試劑，首先移出50 L的液體，參加50 L DMEM-F-12，5 min后移出50 L液體后參加50 L DMEM-F-12，然后抽出全部液體后注入100 L DMEM-F-12，重復(fù)操作3遍，使培養(yǎng)液中殘留盡可能少的玻璃化凍存試劑。1.4.5 FDA/PI染色細胞存活率檢測 將第2代髓核細胞制成懸液，以1108 L-1的細胞濃度接種于6孔板中的蓋 A

27、BCDEF50 m50 m50 m50 m50 m50 m圖1 五種單一凍存試劑處理的髓核細胞FDA/PI染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 m)Figure 1 Fluorescein diacetate/propidium iodide staining of the nucleus pulposus cells after treatment with five commonly used cryoprotectants alone (scale bars=50 m)圖注：圖A-F分別為乙二醇組、丙三醇組、甲酰胺組、二甲基亞砜組、丙二醇組、對照組中髓核細胞FDA/PI染色結(jié)果，綠色為FDA所染，代表活

28、細胞；紅色為PI所染，代表細胞膜受損的細胞及死細胞。玻片上，37 ，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜，實驗組各孔用階梯式參加法緩慢參加相應(yīng)的玻璃化凍存試劑使其濃度到達8 mol/L，對照組不加玻璃化凍存試劑，37 ，體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下孵育1 h，將培養(yǎng)液吸出后向各孔中參加80 L的FDA(15 mg/L)浸染 5 min，PBS漂洗5 min后80 L的PI(15 mg/L)浸染 5 min，PBS漂洗5 min后將蓋玻片取出放置于載玻片上后熒光顯微鏡觀察并照相，用IMAGE PRO PLUS 6.0軟件分析圖片和細胞計數(shù)。細胞存活率(%)=綠染細胞數(shù)/(綠染細胞數(shù)+紅染細胞數(shù))1

29、00%1.4.6 CCK-8細胞活性檢測 實驗組每組設(shè)10個重復(fù)孔，每板中設(shè)置對照組及空白對照組(參加100 L DMEM-F-12，無細胞)，邊緣孔用100 L無菌PBS填充。放置于37 ，體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。實驗組及空白對照組各孔采用階梯式緩慢參加的方法參加相應(yīng)的玻璃化凍存試劑使其濃度緩慢到達8 mol/L， 置于37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育15 min后，采用階梯式移出方法逐步移出玻璃化凍存試劑，對照組不加玻璃化凍存試劑，各組再分別參加10 L CCK-8溶液，置于37 ，體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育1 h。用分酶標(biāo)儀測定 450 nm各孔吸光度A值，各重復(fù)孔A值取平均數(shù)。

30、細胞活性(%)=(實驗組A值-空白對照A值/對照組A值-空白對照A值)100%1.5 主要觀察指標(biāo) FDA/PI染色結(jié)果。FDA/PI染色細胞存活率統(tǒng)計分析結(jié)果。CCK-8細胞活性檢測結(jié)果。1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用s表示，組間均數(shù)差異比擬采用方差分析，兩獨立樣本比擬采用t 檢驗，P 0.05為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results2.1 FDA/PI染色結(jié)果 5種1-CPA處理過的髓核細胞，經(jīng)FDA/PI染色，活細胞被FDA染為綠色，細胞膜受損的細胞及死細胞被PI染為紅色，見圖1。2.2 FDA/PI染色細胞存活率統(tǒng)計分析結(jié)果 1-CPA，2-

31、CPA，3-CPA共25種凍存試劑處理過的髓核細胞經(jīng)FDA/PI染色細胞存活率結(jié)果顯示5種1-CPA處理過的髓核細胞存活率從大到小依次為乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。20種2-CPA及3-CPA，包含有乙二醇(或)丙三醇的組合玻璃化凍存試劑處理過的髓核細胞存活率較高，而包含甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇的2-CPA細胞存活率那么相對較小，所以組合玻璃化凍存試1575ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH圖2 不同組合的玻璃化凍存試劑處理髓核細胞后FDA/PI染色細胞存活率統(tǒng)計分析結(jié)果Figure 2 Statistical analysis

32、 of cell survival rates from the fluorescein diacetate/propidium iodide staining圖注：D：二甲基亞砜；G：丙三醇；P：丙二醇；E：乙二醇；F：甲酰胺。FDA/PI染色結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對照組細胞存活率比擬，20種凍存試劑中包含有乙二醇(或)丙三醇的組合玻璃化凍存試劑處理過的髓核細胞存活率較高。圖3 不同組合的玻璃化凍存試劑處理髓核細胞后CCK-8細胞活性檢測結(jié)果Figure 3 Statistical analysis of cell viability from the c

33、ell counting kit-8 test圖注：D：二甲基亞砜；G：丙三醇；P：丙二醇；E：乙二醇；F：甲酰胺。CCK-8檢測結(jié)果中，單一凍存試劑，2種凍存試劑組合，3種凍存試劑組合及對照組髓核細胞活性比擬，細胞活性從大到小依次為乙二醇、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。細胞存活力(%)細胞存活率(%)劑中參加乙二醇和(或)丙三醇會減弱其對髓核細胞的毒性，而參加甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇那么會增加其對髓核細胞的毒性，見圖2。2.3 CCK-8細胞活性檢測結(jié)果 CCK-8細胞活性和FDA/PI染色細胞存活率結(jié)果根本一致，經(jīng)5種單一凍存試劑中處理過的髓核細胞中, 細胞活性從大到小依次為乙二醇

34、、丙三醇、甲酰胺、二甲基亞砜、丙二醇。2種凍存試劑組和3種凍存試劑組中的細胞活性結(jié)果和FDA/PI染色細胞存活率結(jié)果略有偏差，見圖3。3 討論 Discussion椎間盤退行性變是一種隨年齡逐漸開展的過程，常可導(dǎo)致下腰痛和其他嚴(yán)重的脊柱疾病10，是一個世界性的公眾健康問題，并且導(dǎo)致了嚴(yán)重的社會經(jīng)濟負(fù)擔(dān)11。目前，治療嚴(yán)重椎間盤退行性變最常用的方法是椎體融合，但是，融合后限制了該節(jié)段脊柱的活動，使鄰近節(jié)段脊柱的運動和壓力增加，從而導(dǎo)致鄰近節(jié)段退變加速12。人工椎間盤置換可維持脊柱穩(wěn)定性，保存相應(yīng)節(jié)段脊柱的運動，但是研究說明，人工椎間盤置換可以使脊柱運動方式發(fā)生永久改變，導(dǎo)致相鄰節(jié)段椎體不穩(wěn)以及壓

35、力增加，同樣可加速鄰近節(jié)段退變13，并且存在假體松動，下沉，磨損，自發(fā)融合等一系列問題14。同種異體椎間盤移植是治療嚴(yán)重椎間盤退行性變的一個理想方法，阮迪克等研究同種異體椎間盤移植系列動物實驗及臨床初步應(yīng)用均取得了滿意效果，并對多名同種異體椎間盤移植患者進行5年隨訪，隨訪結(jié)果也非常滿意15，但是由于同種異體椎間盤的供體少、尺寸匹配、保存時間、傳染性疾病等原因限制了其在臨床上的應(yīng)用。所以，探索椎間盤的玻璃化長期保存方法，建立一個椎間盤組織庫，將有助于同種異體椎間盤移植治療的開展。現(xiàn)在無論是臨床還是科研中保存椎間盤均采用慢速冷凍法，玻璃化凍存椎間盤少見報道。成功的玻璃化凍存方法取決于凍存過程中防止

36、損傷細胞的冰晶形成，而防止冰晶形成那么取決于高速的降溫速率和適宜的玻璃化凍存試劑濃度，盡管高濃度的玻璃化凍存試劑可減少冰晶形成，但玻璃化凍存試劑濃度越高毒性越大，對細胞的損傷也越大1。本實驗的目的是檢測各種單一和混合凍存試劑對髓核細胞的毒性，從而為玻璃化凍存椎間盤選擇適宜的凍存試劑。有效的玻璃化試劑的研究和開展需要對各種玻璃化試劑的毒性以及各種玻璃化試劑對于不同種類細胞的毒性充分掌握，目前雖然玻璃化試劑的毒性研究已經(jīng)很多，但是其對髓核細胞毒性的相關(guān)文獻卻很少。此次實驗中用直接和間接2種方法檢測玻璃化試劑對髓核細胞的毒性，F(xiàn)DA/PI染色方法是通過計數(shù)細胞膜受損的細胞數(shù)目來直接評估髓核細胞活性，

37、FDA可穿透細胞膜進入細胞內(nèi)將活細胞染成綠色，死細胞由于細胞膜受損無法累積熒光素而無綠色熒光。PI不能穿透正常細胞的細胞膜，但是可穿透受損細胞或死細胞的細胞膜從而與其DNA或RNA相互作用使得受損細胞顯示紅色熒光，因此，具有完整細胞膜的細胞呈現(xiàn)綠色，細胞膜損傷者那么顯示為紅色。而CCK-8測定是通過檢測吸光度來反映代謝活性從而間接評估細胞活性，適用直接和間接方法共同檢測細胞活性可提高對細胞活性評估的準(zhǔn)確率。此次實驗中對5種最常用的玻璃化凍存試劑及其組合試劑對髓核細胞的毒性進行了排序，在圖1和圖2中可見兩種檢測方法得出了的結(jié)果根本一致，5種單一玻璃化凍存試劑中，毒性最小的為乙二醇，10組2-CP

38、As中，毒性最小的為乙二醇和丙三醇組合溶液；10組3-CPAs混合試劑中，毒性最小的同樣為包含乙二醇和丙三醇的組合溶液。此結(jié)果和研究玻璃化凍存試劑對小鼠桑椹胚16、豬軟骨17、蝦胚胎毒性中乙二醇毒性最小的結(jié)果相一致，然而，研究凍存試劑對魚生殖細胞、鮑魚胚胎18、斑馬魚卵泡毒性中乙二醇和丙三醇毒性均較高19，說明針對不同種屬、不同細胞檢測凍存試劑的毒性可能會有不同的結(jié)果20。所以本實驗的結(jié)果可能不適合其他種屬組織或細胞的凍存，假設(shè)需玻璃化凍存人椎間盤，那么需重新檢測玻璃化凍存試劑對人髓核細胞的毒性。而玻璃化凍存兔椎間盤時那么可選擇包含乙二醇和(或)丙三醇的凍存液。實驗中玻璃化凍存試劑的濃度之所以

39、用8 mol/L，是因為玻璃化凍存椎間盤時必須到達8 mol/L這樣的高濃度才能盡量減少細胞中冰晶的形成從而減小對細胞的損傷。從圖1和圖2可看出，2-CPA及3-CPA毒性均比組成該組合溶液的任意一種單一玻璃化凍存試劑小，原因可能為不同的玻璃化試劑混合時可能會發(fā)生反響21。另外，雖然二甲基亞砜為目前最常用的凍存試劑，但是在實驗中其對髓核毒性卻不是最小的，所以如果因?qū)嶒炐枰褂闷渌拘暂^大的玻璃化凍存試劑(如二甲基亞砜、甲酰胺、丙二醇)，可將乙二醇(和)或丙三醇與其混合以減小其對髓核細胞的毒性。另外，對照組兩種方法檢測得出的細胞成活率為70%，說明含有除玻璃化凍存試劑毒性外的其他因素影響細胞存

40、活率，可能的影響因素有：向96孔板和6孔板接種前需用胰蛋白酶消化貼壁細胞，消化過程導(dǎo)致細胞損傷。細胞培養(yǎng)過程中細胞自然凋亡。其他未知因素。凍存椎間盤時應(yīng)盡量防止除玻璃化凍存試劑之外的其他因素?fù)p傷細胞。此次實驗已成功檢測出目前最常用的5種玻璃化凍存試劑及其20種混合玻璃化凍存試劑的毒性，然而，對于選擇適宜的玻璃化凍存試劑，不僅要求玻璃化凍存試劑有較低毒性，還需要有較高的滲透性22-24。假設(shè)選擇了毒性較小但滲透性較差的玻璃化凍存試劑，其進入椎間盤組織和細胞的量會減少，組織和細胞內(nèi)玻璃化凍存試劑濃度相應(yīng)降低，從而達不到玻璃化凍存所需要的高濃度(約8 mol/L)，導(dǎo)致凍存過程中產(chǎn)生過多損傷細胞的冰

41、晶，最終凍存失敗。所以，作者下一步的工作是檢測這5種單一玻璃化凍存試劑和20種混合玻璃化凍存試劑對椎間盤組織的滲透性，從而為玻璃化凍存椎間盤選擇毒性小、滲透性高的玻璃化凍存試劑。作者奉獻：實驗設(shè)計為胡成棟、李建國；實驗實施為所有作者；實驗評估為李盼、尹合勇；資料收集為劉曦、周玉軍、李海濤、李彥飛、王飛。李建國成文，胡成棟審校。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章有無相關(guān)利益沖突。倫理問題：沒有與相關(guān)倫理道德沖突的內(nèi)容。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻檢測系統(tǒng)進行3次查重。文章外審：本刊實行雙盲外審制度，文章經(jīng)國內(nèi)小同行外審專家審核，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：文章第一作者對研究和撰寫的論

42、文中出現(xiàn)的不端行為承當(dāng)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計算機數(shù)據(jù)庫)記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻 References1 Tsai HH, Tsai CH, Wu WT, et al.Numerical investigation into thermal effects of pre-cooling zone in vitrification- based cryopreservation process. Cryobiology. 2021; 70(1): 32-37.2 Pyne D

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