惡性瘧復(fù)合多價抗原基因在小鼠中免疫應(yīng)答的初步研究

1、惡性瘧復(fù)合多價抗原基因在小鼠中免疫應(yīng)答的初步研究    黃建生張麗蕓郭明秋王昌才任大明 【摘要】目的探索惡性瘧復(fù)合多價DNA疫苗的可行性。方法把帶有ATG的接頭與人工合成的惡性瘧原蟲復(fù)合多價抗原基因AB相連后，構(gòu)建分別帶有SV40或RSV啟動子的真核表達載體pSV2/AB及pREP9/AB,重組表達質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠后，檢測其誘發(fā)特異性體液和細胞免疫應(yīng)答水平及毒副作用。結(jié)果pSV2/AB及pREP9/AB免疫BALB/c小鼠后均誘發(fā)了一定水平的細胞及體液免疫應(yīng)答,帶RSV啟動子的pREP9/AB免疫原性略強于帶SV40啟動子的pSV2/A

2、B, DNA免疫后未見明顯的毒副作用。 結(jié)論惡性瘧復(fù)合多價DNA疫苗可誘發(fā)特異的免疫應(yīng)答,為瘧疾DNA疫苗的研究提供了一定的理論及實驗依據(jù)。 【主題詞】DNA疫苗瘧原蟲，惡性復(fù)合多價基因 Immunogenicity of multivalent antigen gene of Plasmodium falciparum in BALB/c mice Huang Jiansheng, Zhang Liyun, Guo Mingqiu,et al.Institute of Genetics,Fudan University, Shanghai 200433 【Abstract】Objective

3、To study the possibility of multivalent DNA vaccine of P. falciparum. MethodsA multivalent gene AB of P. falciparum was ligated with a 18bp linker,then cloned into the eukaryotic vectors pSV2-neo or pREP9,which possessed SV40 or RSV promoter respectively.The recombinant plasmids pSV2/AB and pREP9/AB

4、 were then intramuscularly injected to BALB/c mice, and the specific humoral and cellular immunity and its side-effects were tested. ResultsThe two recombinant plasmids DNA could induce specific immune reactions without obvious toxicity,which showed that the immunogenicity of pREP9/AB was better tha

5、n that of pSV2/AB. Conclusions The multivalent DNA vaccine of P. falciparum could induce specific immune reactions,which might have provided some new experimental data for the further research of malaria vaccines. 【Subject words】DNA vaccinePlasmodium falciparumMultivalent gene DNA疫苗兼有亞單位疫苗的安全性及減毒活疫苗

6、誘導(dǎo)全面免疫應(yīng)答的高效性，為亞單位疫苗的研究提供了一條嶄新的途徑，已成為疫苗研究的熱點之一1。我們根據(jù)Patarroyo等報道的惡性瘧原蟲復(fù)合SPf66及SPf105多肽序列，人工合成的復(fù)合多價抗原基因AB已經(jīng)在大腸桿菌及減毒鼠傷寒沙門氏菌中獲得高效表達2，3。現(xiàn)把該基因重組到真核表達載體pSV 2-neo(帶SV40啟動子)及pREP9(帶RSV啟動子)中，構(gòu)建pSV2/AB及pREP9/AB重組表達載體，并研究惡性瘧復(fù)合多價抗原基因在小鼠中的免疫應(yīng)答情況。 材料與方法 1. 菌株與質(zhì)粒:E.coli TG1 為復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所國家重點實驗室保存菌種，質(zhì)粒pWRAB、pWR450-1、p

7、SV2-neo及pREP9為第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所提供。 2. 酶:限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、T4多核苷酸激酶均購自Promega公司。 3. 接頭:帶有ATG的18bp接頭為中山醫(yī)科大學(xué)基因診斷中心所合成，序列為: HindEcoRSal 5' AGCTTATGGAATTCATGG 3' 3' ATACCTTAAGTACCAGCT 5' 4. 接頭與AB基因的串聯(lián):見圖1。 圖1 pSV2/AB及pREP9/AB真核表達載體構(gòu)建策略圖 Fig1. Cloning strategy of eukaryotic expression vectors

8、pSV2/AB and pREP9/AB 5. 序列分析及酶切鑒定:用Hind/BamH從pWRAB-1中切下帶有接頭的AB片段，克隆到pUC18中，進行PCR自動測序。 小量抽提質(zhì)粒pREP9/AB 及pSV2/AB，其中pREP9/AB經(jīng)Hind/ BamH雙酶切，8.0% PAGE鑒定; pSV2/AB經(jīng)EcoR酶切后，1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。 6.小鼠免疫:按常規(guī)方法大量抽提質(zhì)粒pSV2/AB、pREP9/AB、pSV2-neo及pREP9。健康雄性BALB/c小鼠，8周齡，1922g/只，每組5只。 DNA溶液注射于小鼠右下肢股四頭肌，注射量均為100g/只。實驗共分為pSV2/

9、AB組、pSV2組、pREP9/AB組、pREP9組及空白對照組(注射100l ddH2O/只)。 7. ELISA法檢測特異性抗體:參照文獻4，5進行, GZ-AB抗原的純化如前所述4。 免疫0周開始自小鼠尾靜脈采血約50l,分離血清,隔周采血一次。鼠抗血清自1100始倍比稀釋。HRP-兔抗鼠IgG購自華美生物工程公司，12000稀釋。陽性對照抗惡性瘧原蟲血清為第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所制備。 8. 遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH):參照文獻4進行，皮下注射抗原GZ-AB 1.0g/只，觀察注射部位變化。 9. 安全性:觀察注射部位變化，小鼠行為、食欲及體重等。免疫后8周，部分小鼠，作大體解剖。

10、結(jié)果 1. 序列分析和質(zhì)粒酶切電泳及結(jié)果:克隆在pUC18帶接頭的AB片段, 經(jīng)PCR測序證實與設(shè)計的一致(結(jié)果未顯示) , 保證了所克隆基因讀框的正確性。 pSV2/AB經(jīng)EcoR酶切后，切出了約2.6kb及3.4kb的兩條目的條帶(見圖2), 這是由于在接頭的5'端設(shè)計了一個EcoRI位點, 使pSV2/AB質(zhì)粒上有兩個EcoR位點; pREP9/AB經(jīng)Hind/BamH酶切后，切出了約360bp的AB片段, 大小正確3。 圖2 pSV2/AB經(jīng)EcoRI酶切的1.0%瓊脂糖電泳圖譜 Fig2. pSV2/AB digested with EcoRI (1.0% agarose)

11、1 pSV2 plasmid; 2 pSV2 EcoRI; 3,4 pSV2/AB EcoRI; 5 DNA Hind 2. ELISA結(jié)果:ELISA結(jié)果用其滴度的倒數(shù)表示(見圖3); pSV2、pREP9及空白對照組抗體滴度均小于1100(未列出)。 圖3 ELISA測定復(fù)合多價DNA疫苗誘發(fā)特異性抗體結(jié)果 Fig3. Specific antibodies induced by multivalent DNA vaccine of P. falciparum detected by ELISA 3. DTH結(jié)果:疫苗組小鼠皮下注射GZ-AB抗原后第二天，可見注射部位出現(xiàn)紅、腫、局部發(fā)熱等

12、明顯的DTH反應(yīng)體征，見表1: 表1 惡性瘧復(fù)合多價DNA疫苗誘發(fā)DTH結(jié)果 Table1. Results of DTH reactioninduced by multivalent DNA vaccines of P.faciparum Group 1d 2d 3d pSV2/AB + + +/- pSV2 - - -      pREP9/AB + + + pREP9 +/- - - Control - - - 4. 安全性: 小鼠免疫后注射部位未見明顯異常體征，食欲正常，未見消瘦，各組體重于免疫后第4周及第8周未見顯著差異。解剖未見小鼠肝及淋巴結(jié)

13、明顯腫大，但pSV2/AB及pREP9/AB疫苗組小鼠脾臟輕度腫大。 討論 DNA疫苗又稱核酸疫苗，其作用機理與普通疫苗有所不同，外源DNA免疫后可在宿主細胞(主要為肌細胞)表達目的蛋白質(zhì)，經(jīng)加工處理后與MHC-類分子形成復(fù)合物，并提呈到細胞表面，由CTL細胞識別發(fā)揮其殺傷作用。有些疾病的DNA疫苗動物實驗已取得可喜的結(jié)果68。其最大優(yōu)點就是可為變異迅速的病原微生物提供交叉防御作用；而且外源DNA不與宿主染色體DNA整合，本身不復(fù)制，但能持續(xù)在宿主細胞中存在，表達所編碼的目的蛋白質(zhì)。因此，對于高度變異的瘧原蟲的防治，DNA疫苗是值得探討的途徑之一。 我們構(gòu)建的惡性瘧復(fù)合多價DNA真核表達載體p

14、SV2/AB及pREP9/AB，重組DNA質(zhì)粒經(jīng)肌肉注射免疫BALB/c小鼠后，無論是體液免疫還是細胞免疫，pREP9/AB都誘發(fā)了比pSV2/AB更強的免疫應(yīng)答，這可能與啟動子RSV更強有關(guān)。DNA疫苗在注射后56周抗體滴度達到最高，這與一般抗原的免疫應(yīng)答有所差異，可能與外源DNA需在肌肉細胞中先表達出足夠多的目的抗原后，才能誘發(fā)有效的免疫應(yīng)答有關(guān)。 惡性瘧DNA疫苗經(jīng)免疫小鼠后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體無不良反應(yīng)，為瘧疾DNA疫苗的研究提供了一定的實驗基礎(chǔ)。由于動物模型的限制(小鼠非惡性瘧動物模型),這些DNA疫苗作用的長期性、保護性及外源DNA能否與染色體DNA整合等，則需進一步研究。 作者

15、單位: 200433 上海, 復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)研究所遺傳工程國家重點實驗室(黃建生，任大明); 第一軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室(黃建生，張麗蕓，郭明秋); 第一軍醫(yī)大學(xué)分子生物學(xué)研究所(王昌才) 參考文獻 1Roberson A. DNA-based vaccines:new possibilities for disease prevention and treatment. Can Med Assoc J, 1995;152(10)1629-1632. 2王昌才,鐘雄林,陳仕榮,等. 惡性瘧原蟲雜合抗原基因的表達及其產(chǎn)物免疫功能的研究.上海免疫學(xué)雜志，1997，17(3)139-142. 3黃建生

16、,王昌才,任大明,等. 惡性瘧原蟲雜合113肽抗原基因在減毒鼠傷寒沙門氏菌SL3261中的表達. 中國寄生蟲病防治雜志, 1995;8(3)173-177. 4黃建生,王昌才,任大明. 惡性瘧原蟲雜合45肽抗原基因在BALB/c小鼠中免疫應(yīng)答的研究. 中國人獸共患病雜志, 1995;11(4)19-23. 5Huang JS,Wang CC,Ren DM, et al. Immunogenicity of recombinant attenuated S. typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of P. falciparum. J Med Col PLA1997;12(2)169-173. 6Lu S,Santoro JC,Fuller DH, et al. Use of DNAs expressing HIV-1 Env and noninfectous HIV-1 particles to raise antibody responses in mice. Virology,1995;209(1)147-153. 7Lagging LM,Meyer K,Hoft B, et al.Immune response to DNA