化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠肝臟低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響

1、化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠肝臟低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響 作者：葉勇 梅國(guó)強(qiáng) 劉松林 石拓 雍雪蓮 張茂林 梅杰【關(guān)鍵詞】 高脂血癥；,低密度脂蛋白；,受體；,化痰活血方摘要：目的觀察化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響，從分子水平探討該方的降脂作用機(jī)理。方法采用高脂乳劑建立大鼠高脂血癥模型后給予化痰活血方，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄?D聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）法測(cè)定大鼠肝低密度脂蛋白受體（LDLR mRNA）水平。結(jié)果化痰活血方能顯著增加高脂血癥大鼠肝臟LDLR mRNA的表達(dá)，與模型組比較有顯著性差異（P0.05或P0.01）；結(jié)論化痰活血方降脂作用機(jī)理可能是通過(guò)提高高脂血癥大鼠低密

2、度脂蛋白受體基因的表達(dá)，從而起到降脂作用。關(guān)鍵詞：高脂血癥； 低密度脂蛋白； 受體； 化痰活血方The Effect of Huatan Huoxue Fang on Hepatic Low Density Lipoprotein Receptor Gene Expression in Hyperlipidemia RatsAbstract：ObjectiveTo explore the molecular mechanism of Huatan Huoxue Fang in prevention on lipid metabolism disorders in hyperlipidemia

3、rats.MethodsFed the rats with lipidemia emulsion to establish the hyperlipidemia model, then applied Huatan Huoxue Prescription. The levels of liver LDLR mRNA were measured by reverse transcriptionpolymerase chain reaction (RTPCR). ResultsThe results of RTPCR showed Huatan Huoxue Fang could upregula

4、ted hepatic LDLR mRNA levels, which showed obvious difference from the model group（P0.05 or P0.01）.ConclusionHuatan Huoxue Fang may prevent lipid metabolism disorders through upregulation of LDLR transcription level.Key words：Hyperlipidemia; Low Density Lipoprotein; Receptor; Huatan Huoxue Fang 化痰活血

5、方是在傷寒論小陷胸湯基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，臨床應(yīng)用于高脂血癥、冠心病的治療取得了滿意的療效1。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，化痰活血方可以顯著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDLC、ApoB水平，升高血清HDLC、HDL2C、ApoAI、的水平，具有較好的降脂作用2。為了從更深層次揭示化痰活血方降脂作用機(jī)理，本研究擬應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，觀察化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響，旨從分子水平揭示該方的降脂作用機(jī)理。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 動(dòng)物健康Wistar大鼠60只，雄性，體重(23020)g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)T

6、JLA2003177）。隨機(jī)分為空白組、高脂血癥模型組、力平脂組、化痰活血方大、中、小劑量組（簡(jiǎn)稱為大、中、小劑量組），每組10只。1.1.2 藥物及試劑 化痰活血方由法半夏、全栝蔞、黃連、當(dāng)歸、土鱉蟲、山楂等組成(均購(gòu)于武漢市藥材公司)，根據(jù)各藥的有效成分，用不同濃度乙醇滲漉，全部藥渣合并煎煮3次，回收乙醇合并全部藥液，濃縮為含生藥4 g/ml濃度的藥液；力平脂（法國(guó)利博福尼制藥公司，批號(hào)為69660），使用前用生理鹽水配成1.8 mg/ml混懸液。膽固醇、膽酸鈉（美國(guó)Sigma公司）；甲基硫氧密啶（北京市燕京制藥廠），丙二醇、吐溫80（湖北醫(yī)藥公司化學(xué)試劑分公司）；TRIzol Reage

7、nt Total RNA試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；PCR試劑盒（寶生生物有限公司）；LDLR（5AAC TAG ACT GCT CCC CCA AGA C3；5CTG CGA TGG ATA CAC TCACTA CTG3）；內(nèi)參照GAPDH由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 Primus 96 Plus PCR儀（德國(guó)MWG Biotech公司）；Hoefer SE 600垂直電泳系列（Hoefer科學(xué)儀器公司）；凝膠自動(dòng)成相儀（GDS 8000，美國(guó)）。1.2 方法1.2.1 動(dòng)物造模參照文獻(xiàn)2方法制備高脂乳劑，即10膽固醇、20豬油、2膽酸鈉、1甲基硫

8、氧嘧啶、20吐溫80、30丙二醇加水至100制成脂肪乳。除空白組外其余各組大鼠以高脂乳劑10 ml/（kgd1）灌胃，1次/d，灌服30 d。1.2.2 給藥方法及標(biāo)本處理 大鼠造模的第11天各組分別給予相應(yīng)藥物灌胃。給藥劑量按藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)3計(jì)算，化痰活血方大、中、小劑量組分別按20.16，10.08，5.04 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌服；力平脂組按0.018 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌服，空白組及模型組以10 ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)灌服生理鹽水。1次/d，連續(xù)20 d。第21天起，末次給藥前禁食12h，給藥1h后，用20烏拉坦0.5 ml/100 g體重麻醉，切開腹部迅速取肝臟，液氮凍存。1.2.3 LDLR m

9、RNA的檢測(cè) 將凍存的肝組織剪碎，采用Trizol常規(guī)一步法提取總RNA，然后測(cè)定RNA樣品含量及純度：A260/A280=1.82.0，說(shuō)明其純度滿足分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。RTPCR法分別擴(kuò)增LDL-R及GAPDH mRNA，取10 l PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在2%瓊脂糖凝膠（含0.5 mg/L溴化乙錠）中電泳，以DL 2 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，電泳緩沖液為1TAE，電泳完畢后，在凝膠自動(dòng)成像儀上進(jìn)行照像、數(shù)據(jù)分析。經(jīng)凝膠密度掃描系統(tǒng)處理，測(cè)定各電泳帶灰度值。待測(cè)基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量以其擴(kuò)增帶吸光度值與相應(yīng)內(nèi)參照擴(kuò)增帶吸光度值的比值表示。LDLR mRNA相對(duì)量=LDLR電泳帶灰度值/GAPDH

10、電泳帶灰度值。1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，t檢驗(yàn)，以P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié)果化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠肝臟LDLR mRNA表達(dá)的影響：RTPCR后，瓊脂糖凝膠電泳在340 bp處顯示出LDLR陽(yáng)性電泳帶，在309 bp處顯示出GAPDH電泳帶（圖1）。從表1可見，模型組大鼠肝臟LDLR mRNA的表達(dá)顯著降低，與空白組比較有顯著性差異（P0.01）?；祷钛礁鲃┝拷M及力平脂組LDLR mRNA的表達(dá)均顯著升高，與模型組比較有顯著性差異（P0.05或P0.01）。其中化痰活血方大劑量組LDLR mRNA相對(duì)含量高于中劑量組和

11、小劑量組，提示在3個(gè)劑量組中以大劑量的療效為佳?；祷钛酱髣┝拷MLDLR mRNA相對(duì)含量與西藥與力平脂組比較，無(wú)顯著性差異（P0.05）。提示化痰活血方具有上調(diào)LDLR mRNA的作用，大劑量化痰活血湯與力平脂的作用相當(dāng)。表1 化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠肝臟LDLR mRNA表達(dá)的影響（略）與空白組比較，P0.01；與模型組比較，P0.01；與力平脂組比較，P0.05；n=10M：marker； 1：空白組； 2：模型組； 3：大劑量組；4：中劑量組； 5：小劑量組； 6：力平脂組圖1 化痰活血方對(duì)LDLR mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。（略）上圖為經(jīng)RTPCR擴(kuò)增后的大鼠肝組織LDLR(340b

12、p)電泳帶；下圖為經(jīng)RTPCR擴(kuò)增后的大鼠肝組織GAPDH(309bp)電泳帶，作為內(nèi)參照3 討論高脂血癥是臨床多發(fā)病、常見病，也是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的主要危險(xiǎn)因素之一。近年研究表明，血脂失調(diào)癥患者存在LDLR功能缺陷和不同程度的損傷，不僅家族性高膽固醇血癥患者有LDLR功能缺陷，而且無(wú)家族性高膽固醇血癥患者中也有相當(dāng)一部分與LDLR功能缺陷有關(guān)4，導(dǎo)致血清中低密度脂蛋白水平升高，形成動(dòng)脈粥樣硬化。人血中70%的膽固醇由低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)攜帶。循環(huán)中低密度脂蛋白膽固醇主要是通過(guò)肝臟低密度脂蛋白受體途徑清除的，因此肝臟LDLR表達(dá)的高低能夠決定并反映血中膽固醇的

13、代謝水平5。LDL通過(guò)攜帶的ApoB100的ApoE與肝細(xì)胞表面的LDLR結(jié)合，被細(xì)胞內(nèi)吞分解成氨基酸和游離膽固醇。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇過(guò)多時(shí)，不但在多個(gè)水平抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)3羥基3甲基戊二酰輔酶(3hydroxy3methylglutarylCoA，HMGCoA)還原酶以減少細(xì)胞本身膽固醇的合成，而且在轉(zhuǎn)錄水平抑制細(xì)胞LDLR蛋白的合成，LDLR數(shù)目減少，從而減少細(xì)胞對(duì)LDL的進(jìn)一步攝取。研究表明，一些降脂藥物如洛伐他汀、非諾貝特能增加LDLR的數(shù)量以降脂。隨著對(duì)降脂中藥研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)有些單味中藥、中藥復(fù)方其降脂作用機(jī)理與提高LDLR基因表達(dá)，解除LDLR的抑制狀態(tài)，使血中LDLC減少，從而調(diào)

14、控血脂水平。如山楂及山楂酮能提高高脂血癥大鼠肝LDLR mRNA的水平6；調(diào)肝導(dǎo)濁中藥能升高實(shí)驗(yàn)性高膽固醇大鼠肝細(xì)胞LDLR mRNA水平7?；祷钛娇梢燥@著降低高脂血癥大鼠血清TC、TG、LDLC、ApoB水平，升高血清HDLC、HDL2C、ApoAI的水平2。為了更進(jìn)一步探討化痰活血方的調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)理，筆者從分子水平觀察了化痰活血方對(duì)高脂模型大鼠低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的影響，結(jié)果進(jìn)一步表明，化痰活血方可以解除高脂血癥時(shí)對(duì)LDLR轉(zhuǎn)錄的抑制作用。其中化痰活血方大劑量組LDLR mRNA相對(duì)含量高于中劑量組和小劑量組，提示在3個(gè)劑量組中以大劑量的療效為佳。而化痰活血方大劑量組LDL

15、R mRNA相對(duì)含量與力平脂組比較差異無(wú)顯著性（P0.05），提示二者在分子水平上對(duì)增強(qiáng)LDLR基因表達(dá)的作用相近。綜上所述，化痰活血方可能通過(guò)增強(qiáng)肝臟LDLR mRNA表達(dá)，繼而促進(jìn)LDLR蛋白合成，增加了肝表面的LDLR數(shù)量與活性，增強(qiáng)肝臟對(duì)脂質(zhì)等代謝功能，加快血中LDLC的清除，加速脂蛋白分解，從而起到了調(diào)控血脂水平的作用。這可能是化痰活血方調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)理之一。參考文獻(xiàn)：1 葉 勇，梅國(guó)強(qiáng).梅國(guó)強(qiáng)教授運(yùn)用化痰活血法治療高脂血癥J.光明中醫(yī)，2003，18(6):22.2 葉 勇，梅國(guó)強(qiáng)，劉松林，等.化痰活血方對(duì)高脂血癥大鼠血脂代謝的影響及其抗氧化作用J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2005， (10):968.3 徐叔云. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)，第2版M.北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：1136.4 秦樹存，王士雯. 低密度脂蛋白受體缺陷的診斷與治療J.心血管學(xué)進(jìn)展，1995，16(1):22.5 Stlning TM，Klocker H，Harwood HJ.In vivo LDL receptor and HMGCoA r