大孔樹脂對三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的吸附性能研究_圖文

1、中國生物工程雜志China B i otechnol ogy,2010,30(4:71276大孔樹脂對三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的吸附性能研究李干祿吳啟賜武振軍石楠萬紅貴3(南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院南京210009摘要為利用大孔吸附樹脂分離純化三孢布拉霉菌發(fā)酵液番茄紅素,考察了4種大孔樹脂(HP20,HP2MG,SP825,SP207對番茄紅素的吸附2解吸特性,篩選出最佳樹脂。結(jié)果表明,HP20大孔樹脂對番茄紅素具有較好的吸附2解吸性能,且吸附迅速,能在1h 內(nèi)達(dá)到吸附平衡。用含55%和60%異丙醇的丙酮不連續(xù)梯度洗脫,回收率可達(dá)89.55%,重結(jié)晶后可獲得純度95%以上的番茄紅素,經(jīng)紅外、

2、質(zhì)譜、核磁等鑒定為天然型番茄紅素。該方法簡單,可操作性強(qiáng),極具工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞三孢布拉霉菌番茄紅素大孔樹脂不連續(xù)梯度洗脫中圖分類號Q819收稿日期:2009212216修回日期:20102022263通訊作者,電子信箱:hg_wansina .com番茄紅素(Lycopene 又名番茄烴,是一種具有11個(gè)共軛雙鍵的不飽和脂溶性天然色素,分子式C 40H 56,分子量536.9,化學(xué)結(jié)構(gòu)上屬于類胡蘿卜素。在所有的類胡蘿卜素中,番茄紅素對單線氧的消除能力最強(qiáng),是2胡蘿卜素的兩倍,抗氧化作用也明顯優(yōu)于2胡蘿卜素,同時(shí)還具有清除自由基、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、減少DNA 損傷等作用122,故其在消除氧自由基

3、、降低癌癥發(fā)病率、增強(qiáng)人體免疫功能以及防治心腦血管疾病方面具有良好的應(yīng)用前景3。目前國內(nèi)應(yīng)用的番茄紅素主要從天然番茄中提取,番茄中番茄紅素的最高含量僅有140200mg/kg,且成本較高、純化工藝復(fù)雜。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)具有成本低、污染小、生產(chǎn)周期短及工藝簡單等優(yōu)勢,是番茄紅素工業(yè)化生產(chǎn)的趨勢。番茄紅素的純化方法主要有大孔樹脂吸附法、重結(jié)晶法和柱層析法等。大孔樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物,是吸附作用和篩選作用相結(jié)合的分離材料,在天然食用色素等方面已有應(yīng)用4。本文對微生物發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素進(jìn)行分離提取及純化,研究和探討了大孔樹脂法分離純化番茄紅色素的影響因素,包括樹脂、解吸劑

4、種類和洗脫方式等,為工業(yè)化生產(chǎn)番茄紅素奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料與試劑菌絲體為本實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵所得;大孔樹脂HP20、HP2MG 、SP207、SP825(北京綠百草公司;甲醇、四氫呋喃為色譜純;丙酮、正己烷、石油醚、異丙醇等均為分析純。1.2儀器高效液相色譜儀為A lltech 2000,色譜柱為A llti m a C18,5,250mm ×4.6mm;番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品(Sig ma 公司;恒溫振蕩器DSHZ 2300A (太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;玻璃層析柱:15mm ×300mm (上海錦華;B ruker AV 400MHz 傅立葉變換NMR 儀(瑞士B ruker 公司。

5、1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1番茄紅素粗提液制備三孢布拉霉菌發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾后,乙醇洗滌,干燥即得到干菌絲體。將菌絲體球磨破壁,再經(jīng)正己烷/丙酮混合液連續(xù)提取,提取液經(jīng)真空濃縮后用適量丙酮溶解,制備成濃縮液,-20保存?zhèn)溆谩?.3.2番茄紅素的含量測定色譜柱為Alltech Allti m aC18,5,250mm ×4.6mm,色譜流動(dòng)相為甲醇四氫呋喃水=66304,檢測波長472nm ,進(jìn)樣量20l,流速1.5m l/m in,柱溫30。樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣,在此條件下番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品在13m in 左右出峰。該標(biāo)準(zhǔn)曲中國生物工程雜志China B i otechnol ogy Vol.

6、30No.42010線方程為Y=1.32×108X-1.81×105,r=0.9999,線性范圍0.0720.36g/m l。1.3.3大孔樹脂預(yù)處理大孔樹脂一般含有未聚合的單體、致孔劑、引發(fā)劑及其分解物、分散劑和防腐劑等脂溶性雜質(zhì),使用前應(yīng)先預(yù)處理。先用無水乙醇浸泡24h,充分溶脹;無水乙醇淋洗,至洗出液加適量水無白色渾濁現(xiàn)象為止;蒸餾水洗至無醇,過濾,室溫下晾干備用。1.3.4靜態(tài)吸附解析實(shí)驗(yàn)各大孔樹脂吸附前用丙酮平衡2h后,準(zhǔn)確量取各樹脂2.00m l置于10m l具塞玻璃試管中,再加入200g/m l番茄紅素濃縮液,蓋緊瓶塞,二者體積比為11.5,避光振蕩吸附4h(

7、25、120r/m in,用丙酮洗滌,再用異丙醇解吸。取樣測定各種樹脂吸附后的上清液、洗滌液和解吸液番茄紅素含量,比較各樹脂的靜態(tài)吸附率與解吸率,篩選出最適合吸附番茄紅素的樹脂。原樣品中番茄紅素含量與上清液,洗滌液和樹脂吸附量呈質(zhì)量平衡關(guān)系,用如下公式計(jì)算吸附量(mg/m l樹脂、吸附率(%、解吸率(%、總回收率(%。QT (mg/m l=(C-Cs-CwV×VA(1(%=(C-Cs-CwC0×100(2RD (%=CEC0-C S-C w×100(3RT (%=CEC0×100(4式中:QT吸附量(mg/ml濕樹脂;吸附率(%;RD 解吸率(%、RT總

8、回收率(%;C原樣品初始濃度(g/ml、CS上清液濃度(g/ml、C W洗滌液濃度(g/ml、C E解吸液濃度(g/ ml;V樹脂體積(ml、V A吸附液體積(ml。1.3.5吸附時(shí)間的確定25時(shí),根據(jù)1.3.4節(jié)的結(jié)果,稱取一定量的樹脂HP20,平衡后裝柱吸附,樹脂體積與番茄紅素濃縮液體積比為11.5,避光水浴振蕩吸附(25、120r/m in,15m in、30m in、45m in、60m in、120m in、180m in、240m in、300m in、360m in時(shí)分別取樣,繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。1.3.6解吸溶劑的確定25時(shí),分別用相同濃度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、異丙醇以及異丙

9、醇/丙酮(體積比為11對吸附了番茄紅素的大孔樹脂解吸,測定解吸液的番茄紅素含量,比較解吸效果。1.3.7洗脫方式的選擇25時(shí),將樹脂HP20置于吸附柱中,用丙酮以0.5m l/m in的流速平衡樹脂3h后,以同樣流速加入適量番茄紅素濃縮液吸附至平衡,再用丙酮洗滌。在一定時(shí)間內(nèi),用含40%90%異丙醇的丙酮對吸附了色素的樹脂進(jìn)行線性梯度洗脫,流速為0.5m l/m in;同時(shí)做平行試驗(yàn),用55%和65%異丙醇的丙酮不連續(xù)梯度洗脫,比較二者洗脫效果。1.3.8穿透曲線特性研究25時(shí),將樹脂HP20置于吸附柱中,加入適量番茄紅素濃縮液,洗脫劑以0.5m l/m in的速度流過吸附柱,分段收集流出液,

10、每次取樣2m l檢測番茄紅素含量,共收集24份,以洗脫液番茄紅素含量(g/m l對洗脫液總體積(m l繪圖擬合得穿透曲線圖。2結(jié)果與討論2.1大孔樹脂的篩選樹脂吸附量的大小是吸附分離提取法的關(guān)鍵,一般來說極性物質(zhì)在非極性介質(zhì)中易被極性吸附劑吸附,非極性物質(zhì)在極性介質(zhì)中易被非極性吸附劑吸附。番茄紅素是一種非極性長鏈烯烴,所以考察4種中低極性樹脂HP20、HP2MG、SP207和SP825對番茄紅素的吸附特性。結(jié)果如表1,4種樹脂對番茄紅素均具有很強(qiáng)的吸附能力,大小順序?yàn)镾P825>HP20>SP207> HP2MG。由于SP825比表面積大,所以吸附率最高,為99.55%,但孔

11、徑較小,解吸則最為困難。HP20孔徑大、比表面積小,吸附率相對SP825較低,但解吸效果最好,其解吸率為81.86%。綜合考慮樹脂的吸附能力和番茄紅素的解吸情況,本文選擇樹脂HP20作為吸附分離番茄紅素的樹脂。表14種吸附樹脂對番茄紅素的吸附2解吸特性Table1St a ti c adsorpti on2desorpti on properti es of4resi n s樹脂型號極性平均孔徑(n m比表面積(m2/g原樣品(g/ml上清液(g/ml洗滌液(g/ml洗脫液(g/ml吸附率(%解吸率(% SP825小571000200 1.60.3117.899.0559.17 SP207小1

12、05630200 2.50.6140.298.4571.20 HP20小260600200 2.40.3161.698.781.86 HP2MG中170470200 4.90.7149.397.276.80 272010,30(4李干祿等:大孔樹脂對三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的吸附性能研究 2.2靜態(tài)吸附時(shí)間的確定吸附動(dòng)力學(xué)主要考察有效成分的吸附量隨時(shí)間的變化過程,部分反映了有效成分在樹脂上的吸附過程。通過吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)可預(yù)測樹脂吸附達(dá)到平衡所需時(shí)間及樹脂對有效成分的吸附速率。因此,吸附速度亦是樹脂吸附性能的重要參考指標(biāo)。圖1為樹脂HP20對番茄紅素的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線,在30m in 前樹脂HP

13、20對番茄紅素的吸附較快,1h 后樹脂對番茄紅素的吸附量趨于穩(wěn)定,隨著時(shí)間的延長,番茄紅素的吸附量呈下降趨勢,主要原因是番茄紅素與空氣接觸被氧化的結(jié)果。因此,本文選擇番茄紅素的靜態(tài)吸附時(shí)間為1h 。 圖1靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線F i g .1St a ti c adsorpti on k i n eti cs curveof HP20resi n a t 252.3解吸溶劑的確定解吸劑必須具備兩個(gè)基本條件:首先,該溶劑應(yīng)能使大孔樹脂吸附溶脹;其次,該溶劑應(yīng)容易溶解吸附物。用間斷稱重法5考察了4種溶劑浸泡下樹脂HP20的溶脹行為,發(fā)現(xiàn)樹脂在乙酸乙酯中的溶脹能力最差,如圖2。又據(jù)報(bào)道,番茄紅素在有機(jī)溶

14、劑中的溶解度順序?yàn)?乙酸乙酯>丙酮>異丙醇>無水乙醇6,由此可見,丙酮同時(shí)具有使樹脂溶脹和溶解番茄紅素的能力,解吸效果最好。實(shí)際應(yīng)用中混合溶劑的使用效果要優(yōu)于單一溶劑,對其進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)異丙醇/丙酮(11,v:v 混合溶劑的解吸效果明顯優(yōu)于丙酮和異丙醇,結(jié)果見表2。因此本文選擇異丙醇/丙酮(11,v:v 混合溶劑作為樹脂HP20的解吸劑。圖2不同溶劑中樹脂HP20的溶脹曲線F i g .2Swelli n g curve of HP20ma tr i x i nd i fferen t solven ts表2不同洗脫液中番茄紅素含量(g /m lTable 2L ycop

15、ene concen tra ti on i n d i fferen teluen ts(g /m l時(shí)間(m in 乙醇丙酮乙酸乙酯異丙醇異丙醇:丙酮(11,v:v 3041.155.425.049.374.86049.663.933.958.785.29053.870.340.665.290.912059.576.346.568.892.72.4洗脫方式的選擇由表3可以看出,采用含40%90%異丙醇的丙酮線性梯度法洗脫,該樹脂對番茄紅素的吸附率和解吸率分別是97.7%和89.4%,異丙醇在混合溶劑中40%70%的比例范圍內(nèi)番茄紅素基本被洗脫。用55%和65%異丙醇的丙酮不連續(xù)梯度洗脫進(jìn)行

16、對照,結(jié)果見表4,其吸附率和解吸率都提高了 1.15%和1.19%,回收率也提高到89.55%?？紤]到生產(chǎn)工藝的簡潔性和可行性,本文選擇含55%和65%異丙醇的丙酮液不連續(xù)梯度洗脫番茄紅素。表3線性梯度洗脫對番茄紅素洗脫的影響Table 3Eluti on stud i es usi n g li n ear grad i en t m ethod for pur i f i ca ti on of lycopene 組分原樣品洗滌液洗脫液異丙醇/丙酮(異丙醇比例,%405060708090番茄紅素含量(g/m l 200 4.6174.721.883.441.7吸附率(%

17、97.7解吸率(%89.40總回收率(%87.3537中國生物工程雜志China B i otechnol ogyVol .30No .42010表4不連續(xù)梯度洗脫對番茄紅素洗脫的影響Table 4Eluti on stud i es usi n g step grad i en t m ethod for pur i f i ca ti on of lycopene 組分性質(zhì)原樣品洗滌液洗脫液異丙醇/丙酮(異丙醇比例,%5565番茄紅素含量(g/m l 200 2.3179.1113.365.8吸附率(%98.85解吸率(%90.59總回收率(%89.55 2.5穿透曲線特性穿透曲線在研究色

18、譜的質(zhì)量傳遞效應(yīng)和測定柱子的穿透容量(即動(dòng)態(tài)吸附量方面有很重要的作用,通過曲線可以了解實(shí)際工況下吸附質(zhì)從流動(dòng)相到吸附相的質(zhì)量傳遞概況以及理論塔板當(dāng)量高度(HETP 。理論塔板數(shù)N 和理論塔板當(dāng)量高度H 可以等效地用來描述柱效率,H 值為1cm 表明該樹脂已有很好的柱效。樹脂HP20的穿透曲線如圖3所示,流出體積42m l 時(shí)開始完全穿透,該樹脂不再吸附番茄紅素,此時(shí)濃度為47.1g/m l 。通過計(jì)算樹脂的動(dòng)態(tài)吸附量為90.38g/m l 濕樹脂,理論塔板當(dāng)量高度HETP 值0.31,理論塔板數(shù)N 32.09,表現(xiàn)出了較好的反相色譜分離性能。 圖3樹脂HP20吸附番茄紅素的穿透曲線F i g

19、.3Breakthrough curve for lycopene usi n gHP20resi n a t 252.6性質(zhì)鑒定純化組分采用低溫結(jié)晶,真空干燥至恒重,所得番茄紅素晶體經(jīng)乙酸乙酯溶解后于無水乙醇中重結(jié)晶。對所得晶體進(jìn)行紅外、質(zhì)譜與核磁鑒定,分析如下:2.6.1紅外光譜取番茄紅素晶體,采用溴化鉀壓片法進(jìn)行紅外光譜檢測,其結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出,番茄紅素晶體樣品表現(xiàn)為典型的共軛多烯結(jié)構(gòu),波數(shù)3035cm 21為2CH 3的特征伸縮振動(dòng)峰。波數(shù)2920,2850cm 21為2CH 22的特征伸縮振動(dòng)峰。波數(shù)1653,1634,1558cm 21為2C =C 2的特征伸縮振動(dòng)峰

20、。波數(shù)957cm21為反式單烯雙取代的C =C 振動(dòng)峰。紅外光譜分析結(jié)果與文獻(xiàn)基本一致7。圖4番茄紅素紅外光譜圖(KBr 壓片法F i g .4I R of lycopene (KBr squa sh m ethod2.6.2質(zhì)譜島津LC 2MS 2010A 高效液相色譜2質(zhì)譜聯(lián)用儀,采用APC I 電離方式,質(zhì)譜圖見圖5、圖6。圖5番茄紅素化學(xué)電離質(zhì)譜圖F i g .5APC I(+2M S of lycopene圖5中,537.5為M +H +,是番茄紅素分子結(jié)合了一個(gè)H +所形成的正分子離子峰。圖6中,536.1為472010,30(4李干祿等:大孔樹脂對三孢布拉霉菌產(chǎn)番茄紅素的吸附性能

21、研究 圖6番茄紅素化學(xué)電離質(zhì)譜圖F i g .6APC I(22M S of lycopeneM 2H ,是番茄紅素形成的負(fù)分子離子峰。由此推算樣品的分子量與番茄紅素分子的理論分子量536.85基本一致。2.6131H 2NMR 儀器為B ruker AV 400,溶劑為氘代氯仿。番茄紅素樣品的氫譜結(jié)果見圖7,化學(xué)位移值見表5。經(jīng)鑒定,所得晶體紅外光譜分析與文獻(xiàn)7基本一致,如圖4,經(jīng)APC I 源質(zhì)譜檢測得分子量為536.7,化學(xué)位移值與標(biāo)準(zhǔn)品有很好的相似性8,如圖7和表5,結(jié)果表明制備的為天然型番茄紅素。3結(jié)論對于發(fā)酵生產(chǎn)的番茄紅素的純化方法國內(nèi)報(bào)道很少,番茄紅素極易被氧化或異構(gòu)化的性質(zhì)也使

22、得它的分離純化較為困難,成為制約發(fā)酵法生產(chǎn)工業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)重要因素。本文較系統(tǒng)地研究了大孔吸附樹脂吸附純化發(fā)酵產(chǎn)物中番茄紅素的方法,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同類型的大孔樹脂對番茄紅素的吸附2解析性能不同,樹脂HP20對番茄紅素的吸附率較高,解吸效果最好,適合于番茄紅素的分離純化。該樹脂對番茄紅素的吸附迅速,能在1h 內(nèi)達(dá)到吸附平衡,具有很好的操作性。用55%和60%異丙醇的丙酮液不連續(xù)梯度洗脫效果較好,回收率可達(dá)89.55%。繪制穿透曲線研究其圖7番茄紅素樣品核磁共振氫譜圖F i g .71H 2N M R spectru m of lycopene特性,經(jīng)計(jì)算得HETP 值和理論塔板數(shù)N 分別為0.

23、31和32.09,表現(xiàn)出了較好的反相色譜分離性能。影響樹脂吸附分離番茄紅素的因素除上述討論的樹脂種類、解吸劑的種類和洗脫方式外,還與番茄紅素的吸附流速、洗脫流速、洗脫溫度以及洗脫體積等諸因素有關(guān)。因此,對番茄紅素的吸附分離仍需作進(jìn)一步的研究。5776 中國生物工程雜志 China B iotechnology 表 5 番茄紅素樣品 1 H 2NM R的化學(xué)位移值 1 Vol 30 No. 4 2010 . p rostate cancer World J U rol, 2003, 21 ( 1 : 9. . 4 汪茂田 ,謝培山 ,王忠東 ,等 . 天然有機(jī)化合物提取分離與結(jié)構(gòu) 質(zhì)子 2, 2

24、 4, 4 7, 7 10, 10 12, 12 15, 15 17, 17 19, 19 1 Clinton S K Lycopene: chem istry, biology, and imp lications for . human health and disease. Nutr Rev, 1998, 56 ( 2 : 35. 2 B ram ley P M. Phytochem istry, 2000, 54 ( 3 : 23. 3 Pohar K S, GongM C, Bahnson R, et al Tomatoes, lycopene and . p rostate can

25、cer: a clinician guide for counseling those at risk for s Abstract The potential of m acroporous resin for separation and purification of lycopene p roduced by B. trispora were investigated. HP2M G, SP825 and SP207 were studied. The op tim al resin for lycopene was screened and selected. The results

26、 exp ressed that HP20 resin had a better adsorp tion 2desorp tion p roperty for lycopene. 1 adsorp tion balance in one hour Purification of lycopene using packed bed colum n by HP20 resin was carried out . using step gradient of 55% isop ropyl alcohol in acetone followed by 65% isop ropyl alcohol in

27、 acetone. A 89. 55% recovery of lycopene was detected by HPLC. After further recrystallisation the purity of lycopene was operate, w ith a good industrial app lication value. above 95% and the structure was confirmed by IR , M S and H 2 NMR. The whole p rocess was sim p le, easy to Key wordsB lakesl

28、ea trispora Lycopene acroporous resin Step gradient elution M Table 5 H 2NM R chem ica l sh ift va lues of the lycopene sam ple 質(zhì)子 化學(xué)位移 化學(xué)位移 (文獻(xiàn) (測定 5. 11 2. 11 6. 49 6. 18 6. 35 6. 62 5. 14 2. 14 6. 49 6. 20 6. 36 6. 64 3, 3 6, 6 8, 8 2. 11 5. 95 6. 26 6. 64 6. 26 11, 11 14, 14 16, 16 18, 18 20, 20

29、 1. 687 1. 818 1. 968 1. 612 1. 968 1. 646 1. 939 化學(xué)位移 化學(xué)位移 (文獻(xiàn) (測定 2. 14 5. 97 6. 26 6. 65 6. 27 5 左榘 ,粟方星 ,朱常英 , 等 . 聚丙烯酸凝膠溶脹行為的研究 . 離 1. 720 1. 802 2. 00 6 李芳 ,孔令明 ,馮作山 . 番茄紅素結(jié)晶溶劑選擇的初步研究 . 食 參考文獻(xiàn) 7 惠伯棣 . 類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué) . 北京 : 中國輕工業(yè)出版 Is lycopene beneficial to human health?. 8 Barrie Tan. Analytical and p reparative chromatography of tomato paste car