同時測量陰離子,陽離子方法驗證

1、同時測量陰離子，陽離子：方法驗證摘要：常規(guī)方法同時檢測陰陽離子采用離子色譜進(jìn)行分析，但費時費力而且無法測定未知物質(zhì)。本文利用新型電噴霧式檢測器與離子色譜相連同時分析陰陽離子，并對分析方法進(jìn)行了驗證。結(jié)果表明，不但靈敏度可低至毫微克水平，而且方法可靠，重現(xiàn)性好，較之單獨的離子色譜更是高效、快捷，適于推廣。 關(guān)鍵詞：ICS-5000，Corona CAD，醋酸銨，陰離子，陽離子 1 前言 同時測定陰離子和陽離子通常用離子色譜法通過一個電導(dǎo)檢測器（ICCD）進(jìn)行分析。這種技術(shù)往往需要明確的被分析物，而且陽離子和陰離子，必須分別的使用特定的平臺測定。一個創(chuàng)新的方法是利用電噴霧使檢測器（Corona C

2、AD.）與離子色譜ICS-5000相連并選用高分子兩性HILIC柱，可將含量低至毫微克級的陰離子、陽離子在一次實驗中同時測定且具有重現(xiàn)性。這種方法允許通過梯度優(yōu)化檢測條件，使更多的分析物可在同一套儀器平臺上測定，包括：陰離子，陽離子，氨基酸，有機(jī)酸，和很多藥物活性物質(zhì)（API）。為廣大使用者提供了一種更快，更經(jīng)濟(jì)的分析方法，優(yōu)化簡單，包括所有相關(guān)元件和流動相組成只需輕微的調(diào)整即可。CAD的靈敏度可檢測出混合物中含有的0.1的離子，而大多數(shù)的混合物是在藥物研發(fā)過程中需要根據(jù)檢測結(jié)果進(jìn)一步調(diào)整的，因此快速提供準(zhǔn)確結(jié)果十分必要。本應(yīng)用注解描述了常規(guī)的梯度法和驗證結(jié)果的具體細(xì)節(jié)。 圖1.覆蓋8個不同濃

3、度（800ppb100ppm;.8 - 1000 ng o.c.）的銨離子或醋酸鹽中離子。2 材料與方法 樣品制備與分析 下列六個鹽都是預(yù)先備好的去離子水溶解的濃度為10mg/mL：硝酸銨，氯化銨，硫酸銨，磷酸銨，醋酸鈉，醋酸鉀。取這些樣品的部分混合，然后用80/20乙腈/水稀釋到大約以下的鹽離子濃度:100，50，25，12.5，6.3，3.2，1.6，0.8g/mL。額外的樣品制備，是用來測試的每一個目標(biāo)離子的檢測方法的準(zhǔn)確性?；衔锖瓦M(jìn)樣濃度列于表1。 這8點標(biāo)準(zhǔn)曲線和精確稱量樣品被轉(zhuǎn)移到安捷倫的聚丙烯瓶。標(biāo)樣4（.12.5mg/mL）在檢測過程中進(jìn)樣22次，來檢查重現(xiàn)性和中間分析準(zhǔn)確性

4、。在檢測過程中流動相分別準(zhǔn)備三次來檢查的方法的適用性。 方法參數(shù) 儀器：離子色譜ICS-5000 色譜柱：Sequant ZIC. - pHILIC; 4.6 x 150毫米，5m 柱溫：30 進(jìn)樣體積：10l 流速：0.5 ml/min 流動相A：100 mM的醋酸銨（pH4.6），甲醇，異丙醇，乙腈（15 v:5 v:20 v:60 v） 流動相B：30mM醋酸銨（pH4.6），甲醇，異丙醇，乙腈（50 v:5 v:20 v:25 v） 梯度：表2 Corona：100pA范圍，無過濾器 樣本瓶：聚丙烯或認(rèn)證的硼硅酸鹽材質(zhì) 表1.方法的準(zhǔn)確性，反離子測定結(jié)果的重復(fù)性 表2.梯度參數(shù) 3結(jié)果

5、與討論 在圖1中，在8個不同濃度點重復(fù)同一實驗。得到的數(shù)據(jù)符合二階多項式的擬合并在上柱81000ng符合線性擬合分別如圖2A和2B所示。這種分析的準(zhǔn)確性通過對有無機(jī)鹽或包含反離子的有機(jī)化合物的比較得以驗證。表2列出的是被測化合物和離子重復(fù)檢測的百分濃度。對所有的離子實驗值始終在5的理論值以內(nèi)以適合標(biāo)準(zhǔn)化線性如圖2A所示。對磷酸鹽離子的檢測限大于8 ng。因此，磷酸鹽只有6個高濃度點（3.2 - 100g/mL）可以用于濃度曲線。其他離子的所有8個點都可用于制濃度曲線。對6種離子進(jìn)行線性回歸分析，每個單獨的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都大于0.9998，符合2階多項式擬合的系數(shù)大于0.993。每一個離子的

6、檢測限，低毫微克水平的上柱測試，列于表3中。 重復(fù)性和中間分析準(zhǔn)確性通過一段時間對標(biāo)樣4（.12.5g/mL每種鹽離子濃度）的峰面積和保留時間的檢查得以檢測。第一天和第二天標(biāo)樣4均進(jìn)樣5次。再為第4天及第7天的實驗準(zhǔn)備1瓶新標(biāo)樣，在這兩天分別重復(fù)進(jìn)樣6次。六個離子的峰面積重現(xiàn)性以及保留時間重現(xiàn)性通過這22數(shù)據(jù)來檢測。第7天的實驗也采用了新的流動相，這會引起保留時間數(shù)據(jù)的小漂移。跨日和日間重復(fù)性結(jié)果分別列于表3和表4。 結(jié)論 本研究收集的數(shù)據(jù)表明，使用Corona檢測器分析離子準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好水平可低至毫微克。所有主要部件通過氯離子，硫酸根，鈉，鉀進(jìn)行了測試驗證。該分析不是一個包括了所有必要的穩(wěn)定性級別的完整的驗證根據(jù)美國FDA Q7A。但它確實證明了檢測器和方法的準(zhǔn)確性，線性，檢測限以及中間精密度。除了方法的靈活性這種驗證分析方法的能力使電噴霧成為一種新型的可替代許多傳統(tǒng)檢測器的實用性技術(shù)。Corona CAD是一個強(qiáng)有力的可以替代ICCD的同時分析陽離子和陰離子的檢測器。 表3.方法靈敏度（色譜柱上樣質(zhì)量，而不是鹽注射濃度）表4.離子保留時間精確度，4個濃度經(jīng)過7天表5.峰面積精密度測試，離子測試(125ng o.c.) 圖2A銨離子或醋酸鹽離子的標(biāo)準(zhǔn)曲線（三次進(jìn)樣平均值，每次