分子生物學(xué)課件第五章：基因表達(dá)調(diào)控真核生物

1、 第五章第五章 基因表達(dá)的調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控 主講教師:劉 靜 中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心分子生物學(xué)研究中心 多細(xì)胞真核生物多細(xì)胞真核生物，遺傳信息從細(xì)胞，遺傳信息從細(xì)胞核的基因組核的基因組DNA傳遞到基因編碼的蛋白傳遞到基因編碼的蛋白質(zhì)均受到多層次的調(diào)控。質(zhì)均受到多層次的調(diào)控。第二節(jié)第二節(jié) 真核生物基因表達(dá)的調(diào)控真核生物基因表達(dá)的調(diào)控 一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)一、真核生物基因表達(dá)的特點(diǎn) 1.1.細(xì)胞具有全能性細(xì)胞具有全能性 全能性：全能性：指同一種生物指同一種生物的所有細(xì)胞都含有相同的基因組的所有細(xì)胞都含有相同的基因組DNADNA，都有，都有發(fā)育

2、成完整個(gè)體的潛能。發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。 2.2.基因表達(dá)的時(shí)間性和空間性基因表達(dá)的時(shí)間性和空間性 時(shí)間性：時(shí)間性：個(gè)個(gè)體發(fā)育的不同階段，基因表達(dá)的種類和數(shù)體發(fā)育的不同階段，基因表達(dá)的種類和數(shù)量是不同的；量是不同的；空間性：空間性：在不同組織和器官在不同組織和器官中，基因表達(dá)的種類和數(shù)量是不同的。中，基因表達(dá)的種類和數(shù)量是不同的。13.3.轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯分開進(jìn)行 真核生物真核生物DNADNA在核在核中轉(zhuǎn)錄生成中轉(zhuǎn)錄生成 mRNAmRNA，穿過核膜至胞質(zhì)指導(dǎo)蛋，穿過核膜至胞質(zhì)指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成；轉(zhuǎn)錄和翻譯不是同步進(jìn)行的，受白質(zhì)合成；轉(zhuǎn)錄和翻譯不是同步進(jìn)行的，受多層次調(diào)控。多層次調(diào)控。

3、4.4.初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工修飾初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后加工修飾 初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為核不均一初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為核不均一RNA RNA （heterogeneous nuclear RNA , hnRNAheterogeneous nuclear RNA , hnRNA）5.5.不存在超基因式操縱子結(jié)構(gòu)不存在超基因式操縱子結(jié)構(gòu) 真核生物基因真核生物基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子。6.6.部分基因多拷貝部分基因多拷貝 某些基因以多拷貝形式某些基因以多拷貝形式存在，如組蛋白和存在，如組蛋白和 tRNAtRNA等，這樣既可滿足細(xì)等，這樣既可滿足細(xì)胞的需要，也是表達(dá)調(diào)控的一種有效方式。胞的需

4、要，也是表達(dá)調(diào)控的一種有效方式。單順反子(monocistron) 編碼編碼一個(gè)一個(gè)多肽鏈的多肽鏈的DNADNA的序列的序列區(qū)域，相當(dāng)于真核細(xì)胞的一個(gè)基因。區(qū)域，相當(dāng)于真核細(xì)胞的一個(gè)基因。translationtranscriptionmRNADNAProteinPromoterGene35單順反子單順反子mRNA (monocistronic mRNA) （一）基因組（一）基因組DNA水平的調(diào)控水平的調(diào)控 1.染色質(zhì)的丟失染色質(zhì)的丟失 不可逆的調(diào)控。不可逆的調(diào)控。 線蟲線蟲 胚胎期：胚胎期：1090個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞 成成 蟲：蟲：959個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞 131個(gè)細(xì)胞在發(fā)育過程中發(fā)生凋亡個(gè)細(xì)胞在發(fā)育過

5、程中發(fā)生凋亡 二、二、真核生物基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制真核生物基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制 2. 基因擴(kuò)增（基因擴(kuò)增（gene amplification） 當(dāng)細(xì)胞對某種基因產(chǎn)物需要量劇增，當(dāng)細(xì)胞對某種基因產(chǎn)物需要量劇增，單純靠調(diào)節(jié)其表達(dá)活性不足滿足需要，只單純靠調(diào)節(jié)其表達(dá)活性不足滿足需要，只有增加這種基因的拷貝數(shù)。有增加這種基因的拷貝數(shù)。 不適當(dāng)?shù)幕驍U(kuò)增可導(dǎo)致某些疾病的不適當(dāng)?shù)幕驍U(kuò)增可導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。發(fā)生。3.基因重排（gene rearrangement）VJ C V JCVJ C 免疫球蛋白免疫球蛋白IgGIgG基因許多片段發(fā)生重排，為免疫球蛋白基因許多片段發(fā)生重排，為免疫球蛋白分子的多樣性奠定

6、了基礎(chǔ)分子的多樣性奠定了基礎(chǔ) 指某些基因片段改變原來存在順序而重新排列組指某些基因片段改變原來存在順序而重新排列組合，成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物多樣性。合，成為一個(gè)完整的轉(zhuǎn)錄單位。調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物多樣性。BCR-ABL融合基因形成示意圖融合基因形成示意圖(140 kDa)(160 kDa)4.4.基因的甲基化修飾基因的甲基化修飾 DNA上特定的上特定的CpG序列處的胞嘧啶發(fā)生甲基序列處的胞嘧啶發(fā)生甲基化修飾（化修飾（5mC）。甲基化程度與基因的表達(dá)一般）。甲基化程度與基因的表達(dá)一般呈反比關(guān)系。甲基化程度愈高，基因的表達(dá)則降呈反比關(guān)系。甲基化程度愈高，基因的表達(dá)則降低。去甲基化，基因的表達(dá)

7、增加。低。去甲基化，基因的表達(dá)增加。GCGCGCGCGene DNA DNA 甲基化甲基化研究研究分析分析方法方法原理：原理：甲基化通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)而調(diào)控基因的甲基化通過影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。通過研究啟動子部位的甲基化狀態(tài)來研究基轉(zhuǎn)錄。通過研究啟動子部位的甲基化狀態(tài)來研究基因轉(zhuǎn)錄活性。因轉(zhuǎn)錄活性。方法：方法：選用識別序列相同但酶切位點(diǎn)不同的對甲基選用識別序列相同但酶切位點(diǎn)不同的對甲基化敏感性內(nèi)切酶對待測序列進(jìn)行酶切?；舾行詢?nèi)切酶對待測序列進(jìn)行酶切。應(yīng)用：應(yīng)用：分析抑瘤基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制；分析抑瘤基因表達(dá)下調(diào)的機(jī)制； 分析組織分析組織/ /發(fā)育階段特異性基因的表達(dá)機(jī)制。發(fā)育階段

8、特異性基因的表達(dá)機(jī)制。 5.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)對基因表達(dá)的調(diào)控作用 組蛋白與組蛋白與DNA結(jié)合與解離是真核基因表達(dá)調(diào)結(jié)合與解離是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要機(jī)制之一?？氐闹匾獧C(jī)制之一。 非組蛋白主要作為反式作用因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)。非組蛋白主要作為反式作用因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)。 常染色質(zhì)中疏松狀態(tài)的活性染色質(zhì)是基因轉(zhuǎn)常染色質(zhì)中疏松狀態(tài)的活性染色質(zhì)是基因轉(zhuǎn)錄前在染色質(zhì)水平上獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制。錄前在染色質(zhì)水平上獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制。1.轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成2.順式作用元件順式作用元件 (cis-acting element)3.反式作用因子反式作用因子 (trans-acting factor)4.轉(zhuǎn)錄水平

9、的調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制 （二）真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控（二）真核生物基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 以以RNA聚合酶聚合酶為例為例1.1.轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成 轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)和和轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(transcription initiation complex, TIC)的形成。的形成。 真核生物真核生物RNA pol不與不與DNA直接結(jié)合，直接結(jié)合，而需要依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。而需要依靠眾多的轉(zhuǎn)錄因子。 2. 順式作用元件順式作用元件(cis-acting element) 指某些能影響基因表達(dá)但不編碼

10、新的指某些能影響基因表達(dá)但不編碼新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)和RNA的的DNA序列序列，按照功能分為，按照功能分為啟動子、增強(qiáng)子、負(fù)調(diào)控元件（沉默子等）。啟動子、增強(qiáng)子、負(fù)調(diào)控元件（沉默子等）。 （ 1）啟動子）啟動子(promoter) 在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(+1)及其及其5上游上游近端大約近端大約100200 bp 以內(nèi)的一組具有獨(dú)以內(nèi)的一組具有獨(dú)立功能的立功能的DNA序列。每個(gè)元件長度約為序列。每個(gè)元件長度約為720 bp，是決定，是決定RNA聚合酶聚合酶轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件。轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件。 真核類基因的順式作用元件圖 核心啟動子核心啟動子(core p

11、romoter) 包括包括“轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)”及其上及其上游游-25-30 bp 處富含處富含TA的典型元件的典型元件“TATA”盒。核心序列為盒。核心序列為TATAAAA，功能：確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。，功能：確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)并產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄。 上游啟動子元件上游啟動子元件( upstream promoter element, UPE)包括通常位于包括通常位于-70 bp 附近的附近的CAAT盒盒(CCAAT)和和GC盒盒(GGGCGG），功能：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。），功能：調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率，提高轉(zhuǎn)錄效率。 （2） 增強(qiáng)子增強(qiáng)子(enhancer)

12、 位于啟動子上游或下游并通過啟位于啟動子上游或下游并通過啟動子增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄效率的動子增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄效率的DNA順順序，增強(qiáng)子本身不具備啟動子活性。序，增強(qiáng)子本身不具備啟動子活性。 (3) 其他元件其他元件 包括負(fù)調(diào)控元件和終止子等。包括負(fù)調(diào)控元件和終止子等。 負(fù)調(diào)控元件負(fù)調(diào)控元件: 沉默子（沉默子（silencer） 或衰減或衰減子（子（dehancer） 真核基因內(nèi)能抑制基因轉(zhuǎn)錄的真核基因內(nèi)能抑制基因轉(zhuǎn)錄的DNA序序列，與反式作用因子相互結(jié)合而起作用。列，與反式作用因子相互結(jié)合而起作用。不受距離和方向的限制，并可對異源基因不受距離和方向的限制，并可對異源基因的表達(dá)起作用。的表達(dá)起作用。

13、終止子終止子 在模板在模板DNA分子的分子的5端轉(zhuǎn)錄終止信號。端轉(zhuǎn)錄終止信號。通常具有通常具有po1yA尾的基因終止信號為尾的基因終止信號為GT簇，例如在簇，例如在SV40中的中的AGGTTTTTT序列為序列為終止轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。終止轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。 3.3.反式作用因子反式作用因子( (trans-acting factor) ) 能直接或間接地識別或結(jié)合在各順能直接或間接地識別或結(jié)合在各順式作用元件式作用元件812bp核心序列上，參與核心序列上，參與調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄效率的一組蛋白質(zhì)一組蛋白質(zhì)。 在結(jié)構(gòu)上含有與在結(jié)構(gòu)上含有與DNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。（1）反式作用因子根

14、據(jù)作用方式分為三類：）反式作用因子根據(jù)作用方式分為三類： 通用轉(zhuǎn)錄因子。通用轉(zhuǎn)錄因子。普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。如普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子。如TATA box結(jié)合因子結(jié)合因子 TFD、GC box結(jié)合因子結(jié)合因子SP1 等。等。組織特異性轉(zhuǎn)錄因子。組織特異性轉(zhuǎn)錄因子。與基因表達(dá)的組織特異性與基因表達(dá)的組織特異性有很大關(guān)系。有很大關(guān)系。誘導(dǎo)性反式作用因子。誘導(dǎo)性反式作用因子。活性能被特異的誘導(dǎo)因子活性能被特異的誘導(dǎo)因子所誘導(dǎo)。所誘導(dǎo)。（2 2）轉(zhuǎn)錄因子）轉(zhuǎn)錄因子( (transcription factor，TF ) ) RNA合成起始所必需的因子。合成起始所必需的因子。TF不依賴不依賴RNA聚合酶而獨(dú)立地

15、結(jié)合聚合酶而獨(dú)立地結(jié)合DNA，在轉(zhuǎn)錄過程，在轉(zhuǎn)錄過程中促使許多中促使許多RNA聚合酶分子與啟動子結(jié)合。聚合酶分子與啟動子結(jié)合。 (2) 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合域轉(zhuǎn)錄活化域TF結(jié)合其它蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（如，二聚化結(jié)構(gòu)域） TFA結(jié)構(gòu)域示意圖結(jié)構(gòu)域示意圖TFA肽鏈的指結(jié)構(gòu)肽鏈的指結(jié)構(gòu)域含有域含有9個(gè)指，與相個(gè)指，與相應(yīng)的應(yīng)的DNA序列結(jié)合，序列結(jié)合，指指“尖尖”可以進(jìn)入可以進(jìn)入DNA雙螺旋的大溝或雙螺旋的大溝或小溝。但羧基端不具小溝。但羧基端不具有指結(jié)構(gòu)，是有指結(jié)構(gòu)，是RNA聚聚合酶合酶和其它的轉(zhuǎn)錄和其它的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的部位。因子相互作用的部位。 TATA因子與因子與TATA盒結(jié)合，盒

16、結(jié)合，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，介導(dǎo)形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，介導(dǎo)RNA聚合酶聚合酶分子轉(zhuǎn)錄。分子轉(zhuǎn)錄。 真核基因開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成圖真核基因開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成圖 RNA聚合酶聚合酶識別并結(jié)合以識別并結(jié)合以上蛋白質(zhì)上蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物。形成復(fù)合物。形成閉合復(fù)合物，閉合復(fù)合物，DNA雙鏈沒有打雙鏈沒有打開，不能啟動轉(zhuǎn)錄。開，不能啟動轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄起始因子與轉(zhuǎn)錄起始因子與RNA聚合酶聚合酶結(jié)合，使結(jié)合，使DNA部分雙螺旋解開部分雙螺旋解開成為開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，成為開放的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，轉(zhuǎn)錄開始合成轉(zhuǎn)錄開始合成RNA。DNADNA識別結(jié)合域：識別結(jié)合域： 鋅指（鋅指（zinc finge

17、r）結(jié)構(gòu)）結(jié)構(gòu) ACys2His2鋅指結(jié)構(gòu)； B折疊的Cys2His2鋅指結(jié)構(gòu)；CCys2Cys2鋅指結(jié)構(gòu)同源結(jié)構(gòu)域（同源結(jié)構(gòu)域（homeodomain，HD） 同源盒基因家族各基同源盒基因家族各基因間具有一相同的保守序因間具有一相同的保守序列。所含的至少二個(gè)列。所含的至少二個(gè)螺旋螺旋中形成中形成“轉(zhuǎn)折轉(zhuǎn)折”，第三個(gè)，第三個(gè)螺旋與螺旋與DNA大溝相互作用，大溝相互作用，是同源盒蛋白與是同源盒蛋白與DNA結(jié)合結(jié)合的主要力量的主要力量 。堿性堿性-亮氨酸拉鏈亮氨酸拉鏈亮氨酸之間相互作用亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成形成二聚體，形成“拉鏈拉鏈” ” 。肽鏈氨基端肽鏈氨基端20203030個(gè)個(gè)富含

18、堿性氨基酸結(jié)構(gòu)富含堿性氨基酸結(jié)構(gòu)域與域與DNADNA結(jié)合。結(jié)合。DNA結(jié)合部位結(jié)構(gòu)域結(jié)合部位結(jié)構(gòu)域疏水性疏水性親水性親水性親水性親水性螺旋螺旋-環(huán)環(huán)-螺旋（螺旋（helix-loop-helix，HLH） 含兩個(gè)雙性含兩個(gè)雙性-螺旋，每螺旋，每34個(gè)氨基酸含一個(gè)個(gè)氨基酸含一個(gè)疏水性殘基，中間為非螺旋環(huán)區(qū)，內(nèi)含一個(gè)或多個(gè)疏水性殘基，中間為非螺旋環(huán)區(qū)，內(nèi)含一個(gè)或多個(gè)能阻斷螺旋的氨基酸殘基。能阻斷螺旋的氨基酸殘基。酸性酸性-螺旋（螺旋（acidic -helix domain） 能非特異能非特異性地與起始復(fù)合物（如性地與起始復(fù)合物（如TATA盒結(jié)合因子）相互作用盒結(jié)合因子）相互作用發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化功能。

19、發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活化功能。富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域（富含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域（glutamine-rich domain） 最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活化域之一。最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活化域之一。富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域（富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域（proline-rich domain） 2)轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域 （transcriptional activation domain）3.3.轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制()反式作用因子的活性調(diào)節(jié)反式作用因子的活性調(diào)節(jié) 真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)，首先表現(xiàn)真核基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)，首先表現(xiàn)為反式作用因子的功能調(diào)節(jié)，即特定的反為反式作用因子的功能調(diào)節(jié)，即特定的反式作用因子被激活后，可以啟動特定基因

20、式作用因子被激活后，可以啟動特定基因的轉(zhuǎn)錄。的轉(zhuǎn)錄。反式作用因子的激活方式反式作用因子的激活方式: :表達(dá)式調(diào)節(jié)表達(dá)式調(diào)節(jié)共價(jià)修飾共價(jià)修飾 A.磷酸化去磷酸化。磷酸化去磷酸化。 B.糖基化。糖基化。配體結(jié)合配體結(jié)合 ：(核受體超家族核受體超家族)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（2）反式作用因子作用方式）反式作用因子作用方式 1）成環(huán)（）成環(huán)（looping）2）扭曲）扭曲(twisting)3）滑動）滑動(sliding)4）Oozing 反式作用因子與順式元件結(jié)合如何影響到反式作用因子與順式元件結(jié)合如何影響到遠(yuǎn)距離遠(yuǎn)距離RNA聚合酶結(jié)合并影響其調(diào)控基因？聚合酶結(jié)合并影響其調(diào)控基

21、因？ （3）反式作用因子的組合式調(diào)控基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一的反式作用因子完成而是幾種因子組合，發(fā)揮特定的作用。1（1 1）報(bào)道基因分析法原理：將調(diào)控序列克隆到含有報(bào)道基因的表達(dá)原理：將調(diào)控序列克隆到含有報(bào)道基因的表達(dá)質(zhì)粒中質(zhì)粒中, ,再轉(zhuǎn)染細(xì)胞再轉(zhuǎn)染細(xì)胞, ,通過報(bào)道基因的活性可檢通過報(bào)道基因的活性可檢測轉(zhuǎn)錄活性。測轉(zhuǎn)錄活性。應(yīng)用：啟動子活性的檢測應(yīng)用：啟動子活性的檢測常用的報(bào)道基因：常用的報(bào)道基因：Luciferase Luciferase （熒光素酶）、（熒光素酶）、 GFPGFP（綠色熒光蛋白）（綠色熒光蛋白）、 SEAPSEAP（分泌性堿性磷酸酶）（分泌性堿性磷酸酶）4.4.轉(zhuǎn)錄水平

22、研究方法轉(zhuǎn)錄水平研究方法1（2 2）DNaseDNase超敏感分析法超敏感分析法原理：轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾樱?jīng)原理：轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域?qū)怂崦缸饔妹舾卸仍黾樱?jīng)DNaseDNase消化常出現(xiàn)長短不均一的消化常出現(xiàn)長短不均一的100100200 bp 200 bp 的的DNADNA片片段，說明此段，說明此 DNA DNA 受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對受組蛋白掩蓋的結(jié)構(gòu)有變化，出現(xiàn)了對DNaseDNase高敏感點(diǎn)高敏感點(diǎn)(hypersensitive site)(hypersensitive site)。方法：用方法：用 DNaseDNase處理細(xì)胞核處理細(xì)胞核DNADNA，再用合適

23、的內(nèi)切酶進(jìn)，再用合適的內(nèi)切酶進(jìn)行消化，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用靶基因的探針進(jìn)行行消化，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用靶基因的探針進(jìn)行southern southern 雜交，根據(jù)片段大小推測基因調(diào)控區(qū)的位置。雜交，根據(jù)片段大小推測基因調(diào)控區(qū)的位置。應(yīng)用：確定基因啟動子內(nèi)調(diào)控區(qū)的位置。應(yīng)用：確定基因啟動子內(nèi)調(diào)控區(qū)的位置。1（3 3）足紋法（）足紋法（foot printing)foot printing)原理：蛋白質(zhì)結(jié)合到DNA序列上，可阻止核酸酶對其的降解。方法：DNA序列與靶蛋白進(jìn)行孵育，再用DNase進(jìn)行切割，電泳，分析圖譜。應(yīng)用：確定DNA結(jié)合蛋白的識別序列。1（4 4）凝膠遷移率凝膠遷移率（gel sh

24、ift assay) 或或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA） 原理：蛋白質(zhì)與特定的DNA序列結(jié)合后，遷移率會發(fā)生改變， DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。方法：純化的蛋白或細(xì)胞粗提液和同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，聚丙烯凝膠電泳，放射自顯影。 應(yīng)用：研究DNA結(jié)合蛋白；RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。(三三)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控1. 5端加帽和端加帽和3端多聚腺苷酸化及意義端多聚腺苷酸化及意義 5端加帽端加帽:真核生物轉(zhuǎn)錄生成的真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA在轉(zhuǎn)錄后，在轉(zhuǎn)錄后，在在5端加上端加上7甲基鳥苷甲基鳥苷 (m7GPPPmNp-)

25、。 意義意義:保護(hù)轉(zhuǎn)錄體保護(hù)轉(zhuǎn)錄體mRNA不受不受5外切酶降解，外切酶降解，增強(qiáng)增強(qiáng)mRNA穩(wěn)定性，有利于穩(wěn)定性，有利于mRNA從細(xì)胞核向胞從細(xì)胞核向胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)mRNA與核糖體結(jié)合（通過帽結(jié)合與核糖體結(jié)合（通過帽結(jié)合蛋白介導(dǎo)完成）。蛋白介導(dǎo)完成）。 3端加尾端加尾:轉(zhuǎn)錄后在轉(zhuǎn)錄后在mRNA在在3末端加上末端加上50150個(gè)腺苷酸，即個(gè)腺苷酸，即poly(A)尾尾。意義意義:保證保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解。2. mRNA前體的選擇性剪接前體的選擇性剪接(alternative splicing)對基因表達(dá)的調(diào)控作用對基因表達(dá)的調(diào)控作用 （1）mRNA前體的剪接前體的剪接 真核細(xì)胞基因表真核細(xì)胞基因表達(dá)所轉(zhuǎn)錄出的達(dá)所轉(zhuǎn)錄出的mRNA前體在剪接酶作用下，前體在剪接酶作用下，有序刪除每一個(gè)內(nèi)含子并將外顯子拼接起來，有序刪除每一個(gè)內(nèi)含子并將外顯子拼接起來，形成成熟的形成成熟的mRNA，這一過程即為剪接。，這一過程即為剪接。 高等真核細(xì)胞中，某個(gè)內(nèi)含子高等真核細(xì)胞中，某個(gè)內(nèi)含子5的供點(diǎn)的供點(diǎn)在特定條件下可與另一個(gè)內(nèi)含子在特定條件下可與另一個(gè)內(nèi)含子3受點(diǎn)進(jìn)行受點(diǎn)進(jìn)行剪接，同時(shí)刪除這兩個(gè)內(nèi)含子及其中間的全部剪接，同時(shí)刪除這兩個(gè)內(nèi)含子及其中間的全部外顯子或內(nèi)含