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1、植物組織細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇的研究進(jìn)展背景介紹 紫杉醇是紅豆杉屬植物中的 一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物, 也是目前所了解的惟一 一種可以促進(jìn)微管聚合和 穩(wěn)定已聚合微管的藥物。藥理 細(xì)胞接觸紫杉醇后會(huì)在細(xì)胞內(nèi)積累大量的微管,這些微管的積累干擾了細(xì)胞的各種功能,特別是使細(xì)胞分裂停止于有絲分裂期,阻斷了細(xì)胞的正常分裂。 通過(guò)-臨床研究,紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌,對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。 獲取紫杉醇的途徑 化學(xué)合成 紅豆杉中提取 真菌發(fā)酵 植物組織培養(yǎng)化學(xué)合成1.全合成: 路線復(fù)雜,反應(yīng)條件難以控制,產(chǎn)率低, 用到劇毒原料,僅限于實(shí)驗(yàn)室水平 2.半合成: 國(guó)外專利
2、技術(shù)壁壘,國(guó)內(nèi)生產(chǎn)附加值低紅豆杉中直接提取 資源匱乏紅豆杉生長(zhǎng)緩慢, 樹皮剝?nèi)『蟛荒茉偕?樹木將死去 紫杉醇在植物體內(nèi)含量極低, 最多0.069% 需多步柱分離技術(shù),生產(chǎn)成本高真菌發(fā)酵 真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇因真菌的紫杉醇含量?jī)H有植物細(xì)胞的十萬(wàn)分之一,離生產(chǎn)的距離太遠(yuǎn)。 從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看,植物組織培養(yǎng)才是解決紫杉醇供需矛盾的最佳途徑。組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)是在無(wú)菌和人為控制外因(營(yíng)養(yǎng)成分、光、溫、濕)的條件下,培養(yǎng)和研究植物組織、器官,甚至進(jìn)而從中分化、發(fā)育 出整體植株的技術(shù)。植物組織培養(yǎng) 愈傷組織培養(yǎng) 繼代培養(yǎng) 懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 紫衫細(xì)胞大量培養(yǎng)愈傷組織培養(yǎng) 選擇合適的外植體:以幼莖為佳 除去病原菌和雜菌:
3、處理外植體 配置合適的培養(yǎng)基。 誘導(dǎo)及培養(yǎng):將上述小塊組織接種于MS培養(yǎng)基中,于25 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40天。PH5.8,誘導(dǎo)和分化,即可形成小的愈傷組織塊 繼代培養(yǎng) 愈傷組織長(zhǎng)出后經(jīng)過(guò)46周的迅速細(xì)胞分裂,原有培養(yǎng)基的水分和營(yíng)養(yǎng)成分多以耗失有害代謝產(chǎn)物已在培養(yǎng)基中積累,必須移植。即是繼代 愈傷組織也易分泌橙紅色色素或發(fā)生褐化,使生長(zhǎng)速度減慢,甚至死亡(這是愈傷組織分泌的酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)造成的)。*緩解褐化 在培養(yǎng)基中加入還原劑或吸收酚類的物質(zhì), 可以減少致死現(xiàn)象,保持愈傷組織的生長(zhǎng)活性。 如:半胱氨酸、維生素C、活性炭 PS:由于吸附劑對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和激素的吸收,較高濃度的吸附劑會(huì)
4、部分地抑制愈傷組織的生長(zhǎng)繼代繼代懸浮懸浮懸浮培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)步驟:步驟:懸浮細(xì)胞培養(yǎng) 只有當(dāng)愈傷組織經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)期固體培養(yǎng),表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)纳矸€(wěn)定性后,才能進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。一般采用B5培養(yǎng)基,碳源多為蔗糖。 溫度、接種量、光照強(qiáng)度,pH值等的改變均能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)率和產(chǎn)物合成 半連續(xù)培養(yǎng):每隔一定時(shí)間倒出一定量的懸浮液,同時(shí)補(bǔ)充加入等量的新鮮培養(yǎng)液 連續(xù)培養(yǎng):連續(xù)收獲細(xì)胞,同時(shí)不斷補(bǔ)充培養(yǎng)液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)排出培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物物紫衫細(xì)胞大量培養(yǎng) 前期利用碳水化合物的選擇加快細(xì)胞生長(zhǎng),使細(xì)胞量迅速增加。達(dá)到一定細(xì)胞量后,改用利于紫杉醇合成的培養(yǎng)液。通過(guò)調(diào)整合成培養(yǎng)液的組成,延長(zhǎng)紫杉醇合
5、成時(shí)間(靜止期)。 為了提高生產(chǎn)率,需要提高活性細(xì)胞濃度,大規(guī)模地培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞?,F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了不少大規(guī)模培養(yǎng)系統(tǒng),同時(shí)使用固定化的細(xì)胞,原位提取等現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)方法能夠在一定程度上提高活性細(xì)胞的濃度。提高紫杉醇產(chǎn)量的方法前體飼喂添加抑制劑添加誘導(dǎo)因子篩選細(xì)胞株系前體飼喂 一方面可通過(guò)增加底物量來(lái)加快反應(yīng)速度和提高產(chǎn)率 另一方面能夠反饋抑制分支路徑而促進(jìn)反應(yīng)順利進(jìn)行,有效提高紫杉醇產(chǎn)量。 常用:苯甲酸,苯甲酰甘氨酸添加抑制劑 添加抑制劑能夠反饋抑制分支路徑而使反應(yīng)向有利于紫杉醇合成的方向進(jìn)行。 發(fā)現(xiàn)合成代謝抑制劑氯化膽堿CCC可以使紫杉醇含量提高,但濃度過(guò)高卻抑制合成。添加誘導(dǎo)子 紫杉醇是一種植
6、物防衛(wèi)素,可以被誘導(dǎo) 茉莉酸甲酯-參與植物防御信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)與放大 花生四烯酸-濃度為5g/g時(shí)即可將紫杉醇含量提高9.3倍,與茉莉酸甲酯表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)協(xié)同作用。篩選出高產(chǎn)的細(xì)胞株系 誘導(dǎo) 變異 細(xì)胞克隆技術(shù)篩選 目前,主要運(yùn)用現(xiàn)代生物基因工程的方法來(lái)獲得高產(chǎn)細(xì)胞系紫杉醇含量高的外植體愈傷組織高產(chǎn)細(xì)胞植株問(wèn)題與前景紅豆杉屬植物組織細(xì)胞培養(yǎng)中紅豆杉屬植物組織細(xì)胞培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)像,尚無(wú)的褐化現(xiàn)像,尚無(wú)良好的解決辦法良好的解決辦法【8】紫杉醇本身是一種細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì)紫杉醇本身是一種細(xì)胞生長(zhǎng)的毒性物質(zhì),其量的其量的積累愈多積累愈多,對(duì)細(xì)胞增殖的抑制越強(qiáng)對(duì)細(xì)胞增殖的抑制越強(qiáng).,即使即使添加真菌添加真菌
7、誘導(dǎo)子及生物合成前體誘導(dǎo)子及生物合成前體,組織細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇組織細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇也難以也難以達(dá)到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用水平達(dá)到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用水平【10】,細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度慢細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)速度慢,有效物質(zhì)含量低、成本有效物質(zhì)含量低、成本高、大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)尚未過(guò)關(guān)高、大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)尚未過(guò)關(guān)【9】添加誘導(dǎo)因子,在一段時(shí)間內(nèi)可以增加紫杉醇產(chǎn)添加誘導(dǎo)因子,在一段時(shí)間內(nèi)可以增加紫杉醇產(chǎn)量,但隨著細(xì)胞的遺傳,會(huì)逐漸產(chǎn)生抗性,是產(chǎn)量,但隨著細(xì)胞的遺傳,會(huì)逐漸產(chǎn)生抗性,是產(chǎn)量降低,這也是無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)的一大原因。量降低,這也是無(wú)法工業(yè)化生產(chǎn)的一大原因。 紫杉醇作為一種抗有絲分裂機(jī)制,在有絲分裂紫杉醇作為一種抗有絲分裂機(jī)
8、制,在有絲分裂過(guò)程中,干擾了細(xì)胞的正常分裂,使紅豆杉細(xì)胞過(guò)程中,干擾了細(xì)胞的正常分裂,使紅豆杉細(xì)胞染色體數(shù)目極易發(fā)生變化染色體數(shù)目極易發(fā)生變化,紅豆杉中紫杉醇的含量紅豆杉中紫杉醇的含量極不穩(wěn)定,因此穩(wěn)定的保存并篩選高產(chǎn)的紫杉醇極不穩(wěn)定,因此穩(wěn)定的保存并篩選高產(chǎn)的紫杉醇細(xì)胞系顯得尤為重要。細(xì)胞系顯得尤為重要。 現(xiàn)今又有一種新的培養(yǎng)高產(chǎn)細(xì)胞系的方法現(xiàn)今又有一種新的培養(yǎng)高產(chǎn)細(xì)胞系的方法,即利即利用秋水仙素誘導(dǎo)建立四倍體紅豆杉細(xì)胞系用秋水仙素誘導(dǎo)建立四倍體紅豆杉細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)證明明,產(chǎn)量是普通二倍體的產(chǎn)量是普通二倍體的3.85倍倍.1313參考文獻(xiàn)1鄧立新.抗癌新藥紫杉醇簡(jiǎn)介.化學(xué)教學(xué),2006年
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