DNA電泳實(shí)驗(yàn)步驟PPT課件

1、 瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動(dòng)時(shí)的電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即分子本身的大小和構(gòu)型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對(duì)分子量成反比。不同構(gòu)型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構(gòu)型的分子：共價(jià)閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構(gòu)型分子進(jìn)行電泳時(shí)的遷移速度大小順序?yàn)?c

2、ccDNAIDNAocDNA 當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。 實(shí)驗(yàn)原理第1頁/共12頁實(shí)驗(yàn)材料：PCR產(chǎn)物,植物基因組DNA,質(zhì)粒DNA等，購買 或自行提取純化。實(shí)驗(yàn)試劑：5TBE電泳緩沖液： 6電泳載樣緩沖液：0.25 溴粉藍(lán)，40(w/v) 蔗糖水溶液，貯存于 4。 溴化乙錠(EB)溶液母液：將EB配制成10 mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器,儲(chǔ)于室溫即可。 實(shí)驗(yàn)材料和試劑第2頁/共1

3、2頁微波爐實(shí)驗(yàn)儀器第3頁/共12頁凝膠電泳槽第4頁/共12頁凝膠成像系統(tǒng)第5頁/共12頁實(shí)驗(yàn)步驟1.取5TBE緩沖液20mL加水至200mL，配制成0.5TBE稀釋緩沖液，待用。 2.膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200mL錐形瓶中，加入50mL 0.5TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液。3.膠板的制備：將有機(jī)玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應(yīng)與膠槽底面保持1mm左右的間隙。 向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠

4、(EB)溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。 第6頁/共12頁4. 加樣：取加樣：取10L DNA樣品與樣品與2L 6上樣液混勻，用微量移液槍小心上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要更換總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣

5、品要更換tip頭，以防止頭，以防止互相污染，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞炕ハ辔廴?，注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。凝膠刺穿。 5. 電泳：加完樣后電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷诤仙想娪静凵w，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在，電流在40mA以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約以上。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，時(shí)，停止電泳。停止電泳。6. 染色：未加染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的的EB溶液中，室溫溶液中，室溫下染色下染色20-25min。 7. 觀察和拍

6、照：在波長為觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有加有EB的電泳膠板。的電泳膠板。 第7頁/共12頁 瓊脂糖通常用水平裝置在強(qiáng)度和方向恒定的電場(chǎng)下電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)中，在中性pH值下帶負(fù)電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定： 1、 DNA的分子大小 2、 瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構(gòu)象 4、 電源電壓 5、嵌入染料的存在 6、 離子強(qiáng)度影響 第8頁/共12頁DNADNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶 第9頁/共12頁1. EB是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，是強(qiáng)誘變劑并有中等毒性，配制和使用時(shí)都應(yīng)戴手套，并且不要把并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專的垃圾要專門處理后才可丟棄。門處理后才可丟棄。2. 當(dāng)當(dāng)EB太多太多, 膠染色過深，膠染色過深，DNA帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸帶看不清時(shí)，可將膠放入蒸餾水沖泡，餾水沖泡，30min后再觀察。后再觀察。 3. 制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則凝固不均勻：速制備凝膠時(shí)，倒膠的溫度不可太低，否則