大腸菌群及大腸桿菌檢測方法

1、出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexportSN016992代替 ZBX09002861 主題內容與適用范圍本標準規(guī)定了出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌的檢驗方法。本標準適用于出口食品的檢驗。2 設備和材料2.1 吸管：1mL,具 0.1mL 刻度；5mL 和 10mL,具 1mL 刻度。22 水浴箱：44.565C。2.3 培養(yǎng)箱：361C,44.5B5C。2.4 冰箱：05c 和-15-20C。2.5 均質器。2.6 乳缽和研

2、棒。2.7 平皿：直徑 90mmo2.8 天平：感量 0.1g。2.9 顯微鏡。2.10 稀釋瓶：100mL、200mL 和 500mL 三角燒瓶及廣口瓶。2.11 玻璃珠：直徑約 5mmo2.12 菌落計數(shù)器。3 培養(yǎng)基及試劑1月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯。1煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯。1EC 肉湯。1伊紅美藍瓊脂（EMB）o1營養(yǎng)瓊脂斜面。1色氨酸肉湯。1MR-VP 培養(yǎng)基。1Korser 氏枸椽酸鹽肉湯。1結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）。1Butterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液。1生理鹽水。1革蘭氏染色液。1Kovacs 氏靛基質試劑。1甲基紅指示劑。1Vogesproska

3、uer（VP）試劑。4 樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品。如有包裝則用 75%乙醇在開口處擦拭后取樣。若不能及時檢驗，應將冷凍樣品置于-15C 保存；非冷凍而易腐的食品，應置于 4c 冰箱保存。檢驗前冷凍本品可于 25C18h 內解凍，或在 45c以下 15min 內解凍。不同食品樣品勻液的制備1液體食品以滅菌吸管取樣 25mL 放入裝有 225mL 稀釋劑的滅菌玻璃瓶（瓶內預置適當數(shù)量的玻璃珠），以 30cm 幅度、于 7s內振搖 25 次（或以機械振蕩器振搖），制成 1:10 的樣品勻液。1固體和半固體食品以無菌操作取 25g 樣品，放入裝有 225mL 稀釋劑的滅菌均質杯內，于 800

4、0r/min 均質 12min,制成 1:10 樣品勻液（也可用滅菌乳缽研磨的方法代替）。稀釋樣品勻液根據(jù)對樣品污染情況的估計，用稀釋劑將樣品勻液制成一系列十倍遞增的樣品稀釋液，如 10-2、10-3、10-4.。從制備樣品勻液至稀釋完畢，全過程不得超過 15min。5 大腸菌群的測定大腸菌群 MPN 值的測定攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀對每個樣品，選擇適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液。每個稀釋度接種三管月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯，每管接種 1mL。攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀將接種管置于 361C 培養(yǎng) 48+2ho攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀觀察試管的產氣情況：檢查倒管內是否有氣泡產

5、生，記錄在 24h 和 48h 內產氣的 LST 肉湯管數(shù)。如所有 LST肉湯管均未產氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則進一步作證實試驗。大腸菌群的證實試驗攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀將所有產氣管用直徑為 3mm的接種環(huán)移種到煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中。攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀置 BGLB 肉湯管于 36?C 培養(yǎng) 482h。攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀記錄所有 BGLB 肉湯管的產氣管數(shù)。攀挀 挀昀戀 愀攙 愀 攀攀結果報告：按 BGLB 肉湯產氣管數(shù)，查 MPN 表（見附錄 B（補充件）報告每克（毫升）樣品中大腸菌群的 MPN 值。6 糞大腸菌群測定用直徑為 3mm 的接

6、種環(huán)將所有 48h 內產氣的 LST 肉湯管培養(yǎng)物移種于 EC 肉湯管中。將所有接種的 EC 肉湯管在 30min 內放入帶蓋 44.505C 水浴箱內，培養(yǎng) 24&h。水浴箱的水平面應高于肉湯培養(yǎng)基液面。應以已知為 44.5C 產氣陽性的大腸桿菌和 44.5C 不產氣的產氣腸桿菌或其他大腸菌群細菌作陽性和陰性對照。記錄 EC 肉湯管的產氣情況。產氣管為糞大腸菌群試驗陽性；不產氣管為糞大腸菌群試驗陰性。結果報告：按產氣管數(shù)，查 MPN 表報告每克（毫升）樣品中糞大腸菌群的 MPN 值。7 大腸桿菌測定將 6.3 條中的 EC 肉湯管繼續(xù)培養(yǎng) 24h,取其產氣管的培養(yǎng)物劃線接種于伊紅美藍

7、（EMB）平板，36?C 培養(yǎng)24+2ho檢查平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。如有典型菌落，則從每個平板上至少挑取 2 個典型菌落；如無典型菌落，則從每個平板上至少挑取 2 個可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養(yǎng)瓊脂斜面上，361C 培養(yǎng) 1824h。將斜面培養(yǎng)物移種到下列培養(yǎng)基中進行生化試驗。色氨酸肉湯：在 361C 培養(yǎng) 242h 后，力口 Kovacs 氏試劑 0.20.3mL,上層出現(xiàn)紅色為靛基質陽性反應。MRVP 培養(yǎng)基；在 361C 培養(yǎng) 482h。以無菌操作移取培養(yǎng)物 1mL 至 13mm100mm 試管中，力口 5%a蔡酚乙醇溶液 0.6mL,40%氫氧

8、化鉀溶液 0.2mL 和少許肌酸結晶，振搖試管后靜置 2h,如出現(xiàn)伊紅色，為 VP 試驗陽性。將 MRVP 培養(yǎng)物的剩余部分再培養(yǎng) 48h 滴加 5 滴甲基紅溶液。如培養(yǎng)物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。Koser 氏枸椽酸鹽肉湯：于 361C 培養(yǎng) 96h 記錄有無生長。LST 肉湯：于 301C 培養(yǎng) 482h,觀察試管中是否產氣。革蘭氏染色：取 18h 營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物作革蘭氏染色。大腸桿菌為革蘭氏陰性。大腸桿菌與非大腸桿菌生化鑒別如下：靛基質 MRVP 枸椽酸鹽鑒定（型別）+-典型大腸桿菌+非典型中間型+典型產氣腸桿菌+非典型產氣腸桿菌如出現(xiàn)上表以外的生化反應類型，表

9、明培養(yǎng)物可能不純，應重新劃線分離，必要時做重復試驗。結果報告：大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發(fā)酵乳糖產酸產氣，IMViC 試驗為+-或-+-,再根據(jù) LST肉湯陽性管數(shù)查 MPN 表，報告每克（毫升）樣品中大腸桿菌 MPN 值。8 大腸菌群固體培養(yǎng)基測定法樣品制備同第 4 章。計數(shù)選取適宜的三個連續(xù)稀釋度的樣品液，每個稀釋度接種兩個滅菌平皿，每皿 1mL。另取 lmL 稀釋劑加入一個滅菌平皿中，作空白對照。8.2.2 將冷至 4510.5C 的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）1015mL 傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養(yǎng)基與樣液充分混勻。待瓊脂凝固后，再加 34mLVRBA 覆蓋平板表

10、層。翻轉平板，置于 36lC 培養(yǎng) 1824h。選用有 30150 個菌落的平板，計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)。菌落直徑為 0.5mm 或更大。證實從 VRBA 平板上挑取 10 個不同類型的典型和可疑菌落，移種于 BGLB 肉湯管內，361C 培養(yǎng) 24h 和 48h,觀察產氣情況。將出現(xiàn)產氣的肉湯管判為大腸菌群陽性。對形成菌膜的陽性管，應進行革蘭氏染色，以便排除革蘭氏陽性桿菌。結果報告經最后證實為陽性（產氣，革蘭氏陰性桿菌）的試管百分比乘以于 8.2.5 條中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克（毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。例：10-4

11、樣品稀釋液 lmL,在 VRBA 平板上有 100 個典型和可疑菌落，挑取其中 10 個接種 BGLB 肉湯管，證實有 6 個陽性管，則該樣品的大腸菌群數(shù)為：1006/10X104/g（mL）=6.0X05/g（mL）附錄 A培養(yǎng)基和試劑（補充件）A1 月桂基硫酸鹽胰蛋白（LST）肉湯胰蛋白或胰酪月東（Trypticase）20g氯化鈉5.0g乳糖5.0g磷酸氫二鉀 (K2HPO4)2.75g磷酸二氫鉀 (KH2P04)2.75g月桂基硫酸鈉 0.1g蒸儲水 1000.0mL將各成分溶解于蒸儲水中。分裝到有倒立發(fā)酵管的 20mrW150mm 試管中，每管 10mL。121c 高壓滅菌 15mi

12、n最終 pH6.80.2。+-+-+-+非典型大腸桿菌+典型中間型A2 煌綠乳糖膽鹽（BGAB）肉湯蛋白腺 10.0g乳糖 10.0g牛膽粉（oxgall 或 oxbile）溶液 200.0mL0.1%煌綠水溶液 13.3mL蒸儲水將蛋白月東乳糖溶于約 500mL 蒸儲水中，加入牛膽粉溶液 200mL（將 20.0g 脫水牛膽粉溶于 200mL 蒸儲水中，pH7.07.5）,用蒸儲水稀釋到 975mL,調 pH7.4。 再加入 0.1%煌綠水溶液 13.3mL,用蒸儲水補足到 1000mL,用棉花過濾后， 分裝到 20mrWl50mm 試管 （管內有倒立的小發(fā)酵管）中，每管 10mL。121c

13、 高壓滅菌 15min。最終 pH7.20.1。A3EC 肉湯胰蛋白或胰酪20.0g3 號膽鹽或混合膽鹽 1.5g乳糖 5.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）4.0g磷酸二氫鉀（KH2P04）1.5g氯化鈉 5.0g蒸儲水 1000.0mL將以上成分溶解于蒸儲水中，分裝 16mrW150mm 試管（管內有倒立的小發(fā)酵管），每管 8mL。121c 高壓滅菌 15min,最終 pH6.91。A4 伊紅美藍瓊脂（EMB）蛋白腺 10.0g乳糖 10.0g磷酸氫二鉀（KH2P04）2.0g瓊脂 15.0g伊紅丫水溶性）0.4g 或 2%水溶液 20mL美藍 0.065g 或 0.5%水溶液 13mL蒸儲水

14、 1000.0mL在 1000mL 蒸儲水中煮沸溶解蛋白月東、 磷酸鹽和瓊脂， 加水補足至原量。 分裝于三角燒瓶中。 每瓶 100mL 或 200mL,高壓滅菌 15min。最終 pH7.110.2。使用前將瓊脂融化，于每 100mL 瓊脂中加 5mL 滅菌的 20%乳糖水溶液、2mL 的 2%伊紅丫水溶液和 1.3mL0.5%的美藍水溶液，搖勻，冷至 4550c 傾注平皿。A5 營養(yǎng)瓊脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白腺 5.0g瓊脂 15.0g蒸儲水 1000.0mL將各成分加于蒸儲水中，煮沸溶解。分裝合適的試管。121c 高壓滅菌 15min。最終 pH7.30.1。滅菌后擺成斜面?zhèn)溆?。A6 色

15、氨酸肉湯胰月東或胰酪腺 10.0g蒸儲水 1000.0mL加熱攪拌溶解胰月東或胰酪腺于蒸儲水中。分裝試管，每管 5mL。121c 高壓滅菌 15min。最終 pH6.90.2。A7MR-VP 培養(yǎng)基月東7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氫二鉀（K2HPO4）5.0g蒸儲水 1000.0mL將各成分溶于蒸儲水中，分裝試管，121c 高壓滅菌 15min,最終 pH6.90.2。A8Koser 氏枸椽酸鹽肉湯磷酸氫鏤鈉（NaNH4HPO4?4H2O）1.5g磷酸氫二鉀（K2HPO4）1.0g硫酸鎂（MgSO4?7H2O）0.2g枸椽酸鈉（含 2H2O）3.0g蒸儲水 1000.0mL將各成分溶解于蒸儲水

16、中，分裝試管，每管 10mL,121c 高壓滅菌 15min。最終 pH6.70.2。A9 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）蛋白腺 7.0g酵母膏 3.0g乳糖 10.0g氯化鈉 5.0g膽鹽或 3 號膽鹽 1.5g中性 0.03g結晶紫 0.002g瓊脂 1518g蒸儲水 1000.0mL將上述成分溶于蒸儲水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調至 pH7.40.1。煮沸 2min,將培養(yǎng)基冷 4550c 傾注平板。臨用時制備，不得超過 3hoA1OButterfield 氏磷酸鹽緩沖稀釋液貯存液磷酸二氫鉀（K2HPO4）34.0g蒸儲水 500mL將磷酸二氫鉀溶于蒸儲水中， 用 lmol/L 氫氧化

17、鈉約 175mL 調至 pH7.2。 用蒸儲水加至 1000mL 貯存于冰箱。 稀釋液取貯存液 1.25mL,用蒸儲水稀釋至 1000mL,分裝于合適容器后，121c 高壓滅菌 15min。A11 生理鹽水氯化鈉 8.5g蒸儲水 1000.0mL將氯化鈉溶于蒸儲水中，121c 高壓滅菌 15min。A12 革蘭氏染色液結晶紫染色液：結晶紫 1.0g95%乙醇 20.0mL1%草酸鏤水溶液 80.OmL將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸鏤溶液混合。革蘭氏碘液：碘 1.0g碘化鉀 2.0g蒸儲水 300.0mL將碘與碘化鉀先行混合，加入蒸儲水少許充分振搖，待完全溶解后，再加蒸儲水至沙黃復染液：沙

18、黃 0.25g95%乙醇 10.0mL蒸儲水 90.0mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸儲水稀釋。染色法a.將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染液，染 1min,水洗。b.滴加革蘭氏碘液，作用 lmin,水洗。c.滴加 95%乙醇脫色約 1530s,直至染色液被洗掉，不要過分脫色，水洗。d 滴加復染液，復染 lmin,水洗、待干、鏡檢。結果：革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。A13Kovacs 氏靛基質試劑對二甲氨基苯甲醛 5.0g戊醇 75.0mL鹽酸(濃)25.0mL將對二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入濃鹽酸即可。A14 甲基紅指示劑甲基紅 0.1g95%乙醇 300mL將甲基紅溶解于 300mL 乙醇中，加水稀釋至 500mL。A15VogesProskauer(VP)試劑甲液a-蔡酚 5.0g無水乙醇 100.0mL乙液氫氧化鉀 40.0g用蒸儲水加 100.0mL附錄 B1g 檢樣中最近似值(MPN)表(補充件)使用三管法，接種量分別為 0.1,0.01 和 0.00lg。陽性管數(shù)MPN陽性管數(shù)MPN0.10.010.0010.10.010.0010001100注：本表采用 3 個稀釋度0.1g(mL)、0