RNAi—雙鏈RNA引起的基因敲除

1、RNAi雙鏈RNA引起的基因敲除CMBI 評論員 李黔1995年，康奈爾大學(xué)的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發(fā)現(xiàn)，反義和正義RNA都阻斷了基因的表達，他們對這個結(jié)果百思不得其解。直到1998年， Andrew Fire的研究證明，在正義RNA也阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA1。這些雙鏈RNA是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時生成的。這種雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)（RNA interference,RNAi）。隨后的研究中發(fā)現(xiàn)，RNAi現(xiàn)象廣泛存在于線蟲，果蠅，斑馬魚，真菌以及植物等生物體內(nèi)，這些生物體利用RNAi來抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的作用

2、。RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，在線蟲，果蠅體內(nèi)，RNAi能達到基因敲除的效果。在小鼠和人的體外培養(yǎng)細胞中利用RNAi技術(shù)也成功阻斷了基因的表達，實現(xiàn)了細胞水平的基因敲除。近幾年來RNAi的研究取得了很大進展，它被Science雜志評為2001年的十大科學(xué)成就之一。2002年RNAi的研究又有了新的突破，發(fā)現(xiàn)它在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，它也名列2002年Science雜志評的十大科學(xué)成就之首。一. RNAi的機理目前RNAi的作用機理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內(nèi)闡明的。生物體內(nèi)的雙鏈RNA可來自于RNA病毒感染，轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，外源導(dǎo)入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發(fā)了細胞

3、內(nèi)的RNAi機制，結(jié)果是病毒被清除，轉(zhuǎn)座子的表達被阻斷，外源導(dǎo)入基因表達被阻斷同時，與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。1 .參與RNAi反應(yīng)的酶RNA酶是一種能切割雙鏈RNA的酶，參與RNAi反應(yīng)的Dicer酶是RNA酶家族的一個成員。Dicer酶廣泛存在于蠕蟲，果蠅，真菌，植物及哺乳動物體內(nèi)。它的結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點。在Dicer酶的作用下，雙鏈RNA被裂解成21到23個核苷酸的片斷，稱為siRNA（short interference RNA）2，它啟動了細胞內(nèi)的RNAi反應(yīng)。由于少量的雙鏈RNA就能阻斷基因的表達，并且這種效應(yīng)可以

4、傳遞到子代細胞中，研究者們推測細胞內(nèi)存在RNAi效應(yīng)的擴增系統(tǒng)。研究者們發(fā)現(xiàn)，在真核細胞中也存在能以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶（RNA-directed RNA polymerase，RdRP）。在RdRP的作用下，進入細胞內(nèi)的雙鏈RNA通過類似于PCR的反應(yīng)過程，呈指數(shù)級的數(shù)量擴增。2 RNAi的反應(yīng)過程雙鏈RNA進入細胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復(fù)合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復(fù)合物形成的蛋白3。此復(fù)合物同與siRNA互補的

5、mRNA結(jié)合，一方面使mRNA被RNA酶裂解，另一方面以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈4，5。結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應(yīng)，細胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。二. 哺乳動物細胞中的RNAi在小鼠的胚胎細胞中也存在RNAi，將727個堿基對的雙鏈RNA轉(zhuǎn)入小鼠的畸胎瘤細胞，誘發(fā)了

6、細胞內(nèi)的RNAi機制，并抑制了報告基因的表達6。但大于30個核苷酸的雙鏈RNA進入哺乳動物的成體細胞后，會非特異的阻斷基因的表達。這是由于當(dāng)長的雙鏈RNA進入哺乳動物成體細胞后，細胞內(nèi)的病毒防御機制被激活。細胞內(nèi)干擾素產(chǎn)生增加，蛋白激酶PKR激活，使轉(zhuǎn)錄因子E2F被抑制，非特異的阻斷基因的轉(zhuǎn)錄，并誘導(dǎo)細胞凋亡。另一方面，RNA酶L(RNase L)被激活，產(chǎn)生非特異的mRNA降解。而未分化的胚胎細胞中，上述防御病毒的機制存在缺陷，因而 雙鏈RNA能特異的阻斷基因的表達。由于大于30個核苷酸的雙鏈RNA非特異的阻斷哺乳動物成體細胞中的基因表達，RNAi在哺乳動物成體細胞中的應(yīng)用受到限制。但Tus

7、chl等人的研究工作克服了這一障礙。他們發(fā)現(xiàn)，21個核苷酸的雙鏈RNA能夠誘發(fā)哺乳動物細胞內(nèi)的RNAi機制，同時不會激活細胞內(nèi)的干擾素 7。他們合成了以熒光素酶的mRNA為靶分子的21個核苷酸的雙鏈RNA，將它和熒光素酶的表達質(zhì)粒用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染到NIH3T3,COS-7,Hela S3,293細胞中，報告基因的表達被抑制了90%。由于報告基因得到的結(jié)果不能完全說明細胞內(nèi)的情況，他們又合成了細胞內(nèi)源性基因laminA/C為靶目標(biāo)的雙鏈RNA，這個雙鏈RNA也特異的抑制了laminA/C的表達，抑制率達到90%以上。根據(jù)一條mRNA的不同靶位點可以合成出許多條雙鏈RNA，研究發(fā)現(xiàn)這些雙鏈RNA的作

8、用差別很大8。其中轉(zhuǎn)錄起始位點，編碼區(qū)的3末端為靶點的雙鏈RNA的效果很差。而GC含量低的區(qū)域似乎雙鏈RNA的效果好。線蟲內(nèi)的siRNA可以作為引物，以靶mRNA為模板，在RDRP及Dicer的作用下，大量擴增siRNA。將siRNA的3末端標(biāo)記上FITC使它喪失引物的作用，在將其轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞內(nèi)，它抑制靶基因的作用并沒有受到影響。因而研究者推測，哺乳動物細胞內(nèi)不存在象線蟲那樣的依賴于RDRP的RNAi放大機制。在哺乳動物細胞中瞬時轉(zhuǎn)染dsRNA后，dsRNA的作用只維持了三天。而將表達dsRNA的載體轉(zhuǎn)入哺乳動物細胞后篩選出的穩(wěn)定表達株中，在轉(zhuǎn)染八周后dsRNA仍能有效的抑制靶基因的表達9

9、。利用載體表達出的dsRNA為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其環(huán)狀部位的核苷酸的序列和數(shù)目對dsRNA的作用都有影響，研究者發(fā)現(xiàn)9個核苷酸比5個或7個核苷酸的效果好9。DsRNA的作用很強，在1nM時就能有效的阻斷靶基因的表達。RNAi還具有很高的特異性。19個核苷酸的dsRNA幾乎可以完全抑制基因的表達，而將其中的一個核苷酸突變掉后，它對基因的抑制作用就消失了9，這對dsRNA的應(yīng)用是非常重要的，這可以避免dsRNA降解與靶mRNA同家族的其他的mRNA。三. 雙鏈RNA的構(gòu)建雙鏈RNA可先在體外構(gòu)建好，然后轉(zhuǎn)染細胞。在體外構(gòu)建雙鏈RNA時，分別在體外轉(zhuǎn)錄出正義和反義RNA，再將兩者退火，形成雙鏈RNA。體外合

10、成的雙鏈RNA可以用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入細胞中。但有些細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移效果差，轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的雙鏈RNA半衰期短。而先在體外構(gòu)建能表達雙鏈RNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)在細胞內(nèi)合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉(zhuǎn)染細胞的種類，而且在長期穩(wěn)定表達載體的細胞株中，雙鏈RNA能夠長期發(fā)揮阻斷基因的作用。在構(gòu)建雙鏈RNA的表達載體時，使用RNA多聚酶來指導(dǎo)RNA的合成。這是因為RNA多聚酶有明確的啟始和終止序列，而且合成出的RNA不會帶有polyA尾。當(dāng)RNA多聚酶遇到連續(xù)5個胸腺嘧啶時，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會終止，并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二個尿嘧啶處被切下來。U6啟動子能被RNA多聚酶識別， 合成出RNA。ShiYang10

11、等人用Bluescript作為載體，U6作為啟動子，從綠色熒光蛋白（GFP）的基因上選擇了一個21個核苷酸的片斷（片斷1），將其插入到Bluescript載體中。然后合成出片斷1的反向重復(fù)序列，并在其后加了5個胸腺嘧啶，稱為片斷2。他們將片斷2接到Bluescript載體中片斷1的后面，將載體轉(zhuǎn)移到細胞中后，轉(zhuǎn)錄出的RNA由于具有回文序列，會形成一個發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，從而得到了雙鏈RNA。片斷后面加了5個胸腺嘧啶，RNA轉(zhuǎn)錄到這個位置時就會終止。而且轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)后，會在3端形成2個突出的尿嘧啶，這類似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發(fā)RNAi。RNA多聚酶還能識別H1-RN

12、A 啟動子。在H1-RNA 啟動子后面接上能形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)的反向互補序列，將此載體轉(zhuǎn)入細胞后也能在細胞內(nèi)合成dsRNA9。T7也可作為啟動子合成dsRNA。將PCR產(chǎn)物用NotI酶切后自身連結(jié)，回收正向片斷和反向片斷連結(jié)形成的具有反轉(zhuǎn)重復(fù)序列的片斷，接到pGEMTeasy載體上，就構(gòu)建成了可以表達dsRNA的載體。用此載體可先在體外合成dsRNA,或?qū)⑵滢D(zhuǎn)入到細胞內(nèi)合成dsRNA。在后一種情況下，還須將能表達T7RNA多聚酶的載體也一起轉(zhuǎn)入到細胞中，以提供能識別T7啟動子的RNA多聚酶11。雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動物細胞的基因表達。而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達的時間。在小

13、鼠畸胎瘤細胞，胚胎干細胞，C2C12細胞中，用長鏈具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA有效的阻斷了報告基因的表達，在穩(wěn)定表達具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的細胞株中，報告基因的表達被長期的阻斷了12。腺病毒是體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內(nèi)和體外表達dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達，從而實現(xiàn)了成體動物的基因敲處13。四. RNAi的應(yīng)用1. 高通量的研究基因功能在后基因組時代，需要大規(guī)模高通量的研究基因的功能，由于RNAi能高效特異的阻斷基因的表達，因而RNAi成為研究基因功能的很好的工具。研究者將線蟲三號染色體上2232個基因?qū)?yīng)的dsRNA合成出來，并注射到線蟲性腺內(nèi)，

14、然后觀察子代細胞分裂時出現(xiàn)的異常表型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了133個基因與細胞分裂異常有關(guān)。其中104個基因以前沒有發(fā)現(xiàn)有這種功能。在另外一項研究中，線蟲一號染色體上的2416個基因?qū)?yīng)的dsRNA被構(gòu)建到細菌文庫中，然后將細菌喂給線蟲，觀察形態(tài)學(xué)的異常，異常的運動，性別比例的變化，不孕的情況，結(jié)果將于這些表型有關(guān)的基因從70個增加到178個。2. 基因敲除在線蟲的體內(nèi)外試驗中，RNAi都能達到基因敲除的結(jié)果，從而成為研究這些基因功能的良好工具。對于哺乳動物，RNAi能在體外培養(yǎng)的細胞達到基因敲除的效果，對于一些敲除后小鼠在胚胎時就會死亡的基因，可以在體外培養(yǎng)的細胞中利用RNAi技術(shù)研究它的功能。由于RN

15、Ai能高效特異的阻斷基因的表達，它成為研究信號傳導(dǎo)通路的良好工具。在線蟲體內(nèi)，胰島素和受體結(jié)合后可以活化DSOR1,它是MEK的類似物，DSOR1活化后可以激活ERKA,它是ERK的類似物。用以DSOR1為靶目標(biāo)的dsRNA可以阻斷DSOR1的表達，雖然總的ERKA的表達不受影響，但由于DSOR1的表達被抑制，因而胰島素刺激后ERKA不能活化。RNAi還被用來研究在發(fā)育過程中起作用的基因，如可用RNAi來阻斷某些基因的表達，來研究他們是否在胚胎干細胞的增殖和分化過程中其起著關(guān)鍵作用。3. 基因治療目前抑制基因表達常采用反義技術(shù)或轉(zhuǎn)入沒有功能的突變體與該基因競爭。這兩種方法對基因表達的抑制都不如

16、RNAi高效特異持久。作為基因治療的工具，RNAi既高效特異，又簡便易行。RNAi在某個基因表達異常增高引起的疾病中會非常有用，如病毒感染，腫瘤等。CDK-2是調(diào)控細胞周期的一個關(guān)鍵基因，用以CDK-2位靶目標(biāo)的dsRNA能阻斷99.7%的細胞中CDK-2的表達，而在對照中只有0.2%的細胞中CDK-2基因的表達降低10。因而，以CDK-2位靶目標(biāo)的dsRNA能治療細胞異常增殖相關(guān)的疾病，如腫瘤等。DsRNA還可以抗病毒治療。研究者們將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉(zhuǎn)染到293細胞中，rev基因的表達被顯著抑制14。CD4基因編碼細胞表面HIV病毒的受體，用針對CD4的ds

17、RNA能將細胞表面HIV病毒的受體表達減少75%，從而抵抗HIV病毒的感染。 4. 基因表達調(diào)控今年研究者發(fā)現(xiàn)RNAi在Epigenetics中發(fā)揮重要作用。Epigenetics是指至少一代的基因表達的改變，而基因的編碼沒有改變。今年研究者發(fā)現(xiàn)，epigenetics調(diào)控的一種類型是染色體的改變。通過改變?nèi)旧w的形狀（更緊或是更松），能夠決定那一個基因表達。但什么促進了染色體形狀的改變以前并不清楚。今年研究者發(fā)現(xiàn)，siRNA在染色體形狀的改變中起著非常重要的作用。這樣RNAi能永久的關(guān)閉基因的表達，而不僅僅是短期的抑制它。通過在發(fā)育過程中關(guān)閉或開放基因的表達，siRNA可能指導(dǎo)著細胞的定向分

18、化。RNAi已被證實能引導(dǎo)植物干細胞的分化，因而研究者認為RNAi也可能參與指導(dǎo)人的干細胞的分化。由于RNAi在基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，對RNAi微小的干擾就可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。 目前RNAi在非脊椎動物如線蟲，果蠅，以及植物中的應(yīng)用已經(jīng)取得了很多重要的成果，但在哺乳動物中的應(yīng)用還處于起步階段。在哺乳動物細胞中，RNAi并不能完全阻斷基因的表達，特別是表達異常高的基因。Tuschl等人的研究工作中，有三個基因被抑制了90%，但有一個基因沒有被抑制，這就是一個表達很高的基因。另外，運載體系一直是體內(nèi)基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA高效特異的轉(zhuǎn)入體內(nèi)仍是一個難題。目前已能用腺病毒作為載體在體

19、內(nèi)實現(xiàn)RNAi,但仍需要尋找更為安全有效的載體。參考文獻1 Fire A, Xu S, Mello CC.et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 1998 ;391(6669):806-112 Bernstein E, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Natur

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