高效毛細管電泳的臨床應(yīng)用及進展

1、高效毛細管電泳的臨床應(yīng)用及進展高效毛細管電泳（highnbsp;performancenbsp;capillarynbsp;electriphoresis，HPCE）上在傳統(tǒng)電泳基礎(chǔ)上繼現(xiàn)代高效液相色譜技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新型高效分離技術(shù)，由于它具有無法比擬的高效和快速性，因而受到越來越多科學家們的青睞。 沈霞 高效毛細管電泳（high performance capillary electriphoresis，HPCE）上在傳統(tǒng)電泳基礎(chǔ)上繼現(xiàn)代高效液相色譜技術(shù)之后發(fā)展起來的一種新型高效分離技術(shù)，由于它具有無法比擬的高效和快速性，因而受到越來越多科學家們的青睞。一、毛細管電泳的發(fā)展史1967

2、年在高電場作用下，以3mm直徑的毛細管內(nèi)進行自由溶液的區(qū)帶電泳，1974年報道了以200500um內(nèi)徑玻璃毛細管內(nèi)進行的區(qū)帶電泳分析，早期的研究受當時檢測靈敏度的影響，未獲預(yù)期的高效分離效率，但為毛細管電泳分離的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1981年人們第一次展示了毛細管區(qū)帶電泳，使用75um內(nèi)徑的玻璃毛細管和熒光檢測器進行在線檢測，在30KV電壓下，分離了氨基酸和多肽類物質(zhì)，塔板數(shù)高達40萬，這一工作被認為是現(xiàn)代毛細管電泳發(fā)展的里程碑。1983年將聚膠柱制備困難的缺點。1984年使用含有表面活性劑的背景電解質(zhì)，開辟了毛細管電泳另一個重要分支-膠束毛細管電動力學色譜。1987年又結(jié)合傳統(tǒng)的等電聚焦電泳和凝

3、膠電泳原理，并移到毛細管內(nèi)進行電泳，1988年實現(xiàn)了微量制備的可能性，提取和分離了50umol的蛋白質(zhì)、肽和寡核苷酸等。80年代未，國內(nèi)外毛細管電泳的研究非?；钴S，于1989年推出第一批毛細管電泳儀，90年代起在技術(shù)和儀器應(yīng)用等方面都有了很大的發(fā)展，1990年改進和應(yīng)用了紫外檢測器，1992年激發(fā)誘導熒光檢測器誕生，毛細管電泳技術(shù)得到不斷改進和更新，敏感度和分辨率均達到預(yù)期的高效分離效率。二、高效毛細管電泳的基本原理粒子在電場的作用下，以不沒的速度向電荷反方向遷移和現(xiàn)象，是一種在空芯、微小內(nèi)徑的毛細管（內(nèi)徑10200um）中進行的大、小分子的高效分離技術(shù)，毛細管兩端分別浸入緩沖液中分別插入連有

4、高壓電源的電極，該電壓使得分析樣品沿毛細管遷移，根據(jù)被分離物之間電荷和體積的不同，各種分子在高電壓下被分離，在自由區(qū)帶毛細管電泳中，電泳的移動（帶電荷分子朝相反極性的電極方向移動）和電滲流（在毛細管內(nèi)壁上的電荷和應(yīng)用的勢能而引起的電解質(zhì)移動）導致了分離。電滲流的大小取決于電場強度、電解質(zhì)的PH、緩沖液的組成和離子強度、內(nèi)磨擦和毛細管表面的等特點，這些因素能單一或互相結(jié)合地提高分離效果，檢測可使用UV直接通過毛細管上的小窗口進行檢測，也可選擇激光誘發(fā)熒光、二極管陣列、電化學和質(zhì)譜檢測器檢測。樣品進樣方式是應(yīng)用氣壓或電壓將樣品壓入毛細管中完成。高效毛細管電泳具有多樣化分離模式，其分離的機理是不同的

5、，它們之間具有相互補充的作用。三、高效毛細管電泳的分離模式1毛細管區(qū)帶電泳（Capillary Zone Electroporesis，CZE）分離原理：毛細管區(qū)帶電泳出稱為自由溶液毛細管電泳，是毛細管電泳是最簡單的一種形式。其分離機理是基于各被物質(zhì)的凈電荷與質(zhì)量之間比值的差異，不同離子按照各自表面電荷密度的差異，以不同的速度在中解質(zhì)中移動而導致分離，它要求緩沖液具有均一性，毛細管內(nèi)各處具有恒定的電場強度，是目前應(yīng)用最廣的一種分離模式。適用于蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽類和離子的分析。毛細管中除電解液外，無需填充任何物質(zhì)，操作容易，自動化程度高。毛細管凝膠電泳（Capillary Gel Electr

6、ophoresis，CGE）分離原理：凝膠電泳是凝膠移到毛細管中用為支撐物進行分離的區(qū)帶電泳。凝膠是一種固態(tài)的分散的體系。具有多孔性，類似于分子篩的作用，被分離物在通過裝入毛細管內(nèi)的凝膠力，按照各自分子的體積大小逐一分離，分子體積大的首先被分離出來，適用于生物大分子的分析，可純粹按分子體種大小進行分離（SDS-PAGE），以決定蛋白質(zhì)的分子量，可以識別一個堿基差異的寡核苷酸，可分離DNA片段，如微衛(wèi)星（STR）分析，可改變凝膠的濃度不控制分離的范圍，如PCR產(chǎn)物的分析。3膠束電動斬學毛細管色譜（Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，M

7、ECC）分離原理：是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)的交叉，當把離子型表面活性劑加入緩沖液中，并且其濃度足夠大時，這種表面活性劑的單體就結(jié)合在一起，形成球體（膠束）。目前以十二烷基磺酸鈉（SDS）膠束用的最為普遍，MECC存在二個相之間分配，由于它們在膠束中具有保留能力而產(chǎn)生不同的保留時間，和CZE一增，緩沖液在管壁處形成正電，產(chǎn)生強烈的向負極方向移動的最滲流，面SDS膠束由于外殼帶負電性，具有向正極遷移的傾向，一般電滲流的速度膠束向正極遷移速度，迫使膠束最終以較低的速度向負極移動。中性粒子之間的分離是根據(jù)其本身的疏水性的不同而達到的，不同疏水性的粒子和膠束的相互作用不同。疏水性強的作用力大，保留的時間長。

8、MECC是目前惟一既能分離中性離子又能分離帶電組分的HPCE模式。4等電聚焦電泳（Isoelectric Focusing，IEF）分離原理：兩性電解質(zhì)在分離介質(zhì)中的遷移，在毛細管內(nèi)形成pH梯度，各種具有不同等電點的多肽和蛋白質(zhì)按照這一梯度遷移到其不同的等電位置并停下，由此產(chǎn)生一條非常窄的聚焦區(qū)帶，利用等電點的細微差異進行分離，將不同的蛋白質(zhì)聚焦在不同的位置上后，陰極的緩沖液換成鹽類，再加上高壓，使末端引起梯度降低，讓組分一個個通過檢測器可求得精確的等電點。5等速聚焦電泳（Isotachophoresis，ITP）分離原理：在被分離組分與電解質(zhì)一起向前移動的同時進行聚焦分離的電泳方法，與IEF

9、一樣，ITP在毛細管中的電滲流為零，緩沖系統(tǒng)由前后兩種不同淌度的電解質(zhì)組成，分離時毛細管內(nèi)首先導入尾隨電解質(zhì)（淌度低于被分離組分）。在強電場的作用下，各被分離組分在兩種電解質(zhì)之間的空隙是發(fā)生聚焦分離。選擇處理或未處理硅交毛細管均右，電滲流可用0.25%羥脯氨酰甲本纖維抑制.前導電解質(zhì):5nM磷酸,尾隨電解質(zhì):纈氨酸,在分離開始時,電流會由于高淌度的電解質(zhì)完全充滿毛細管而迅速增大,進入分離過程時,電流會隨著低淌度的電解質(zhì)進入毛細管而下降.6.毛細管電色譜(capillary electrochromatography,CEC)分離原理:是將高效液相色譜眾多的固定相填沖到毛細管中,以樣品與固定相間

10、的相互作用為分離機制,以電流流相為驅(qū)動力的色譜過程.7.親和毛細管電泳(affinity capillary electrkphoresis,ACE)分離原理:在電泳過程中具有生物專一性親和力,即受體(recepror)和配體(ligand)相互間發(fā)生的特異親和作用.形成了受體的配體的復合物.對受體和配體在發(fā)生親和作用前后的電泳圖譜變化,可獲得有關(guān)受體和配體親和力大小結(jié)構(gòu)變化作用產(chǎn)物等方面的信息.8.電動色譜(electrokinetic chromatography,EKC)分離原理:是根據(jù)電動現(xiàn)象命名的一種電泳模式,涉及電滲,電泳和色譜三方面的原理,主要用于手性化合物的分離.9.非水相毛細

11、管電泳(non-aqueous capillary electrphoresis,NACE)分離原理:是分析物在有機溶劑中進行電泳分離的一種模式,使用非水相介質(zhì)可增加方法的選擇性,并有利于非水溶性物質(zhì)的分離.四、高效毛細管電泳的臨床應(yīng)用1血清蛋白質(zhì)分析,采用CE分離血清蛋白獲得的效果，并能準確計算各蛋白質(zhì)的相對濃度，避免了凝膠電泳法染色，脫色過程中多種影響因素造成的誤差，HPCE法的結(jié)果重復性好，可信度高，便于貯存和檢索。前白蛋白在血清中的濃度可表明營養(yǎng)狀態(tài)，且是確定惡性腫瘤、炎癥、肝硬化、何杰金氏病的重要指標，多數(shù)電泳法難以分辨，而用HPCE法很容易分離定量，檢測波長為214或200nm.C

12、E增加了增加了白蛋白部分的分辨率,這導致對雙白蛋白血癥檢測的靈敏度有了很大的提高.CE提供了足夠的在1區(qū)的分辨率以區(qū)分1酸性糖蛋白與1抗胰蛋白酶.在2區(qū)的球蛋白區(qū), 2巨球蛋白與觸球蛋白不易區(qū)分,但在-球蛋白區(qū)具高分辨率,CE法對腎病綜合征,慢性炎癥,自身免疫病和肝硬化等多克隆免疫球蛋白的分析顯示明確的特征,血清蛋白電泳是單克隆蛋白(monoclonal protein,MP)血癥重要的篩選試驗,如多發(fā)性骨髓瘤,巨球蛋白血癥,對典型的單克隆輕鏈和你濃度單克隆蛋白的檢測有較高的敏感性.寡克隆蛋白成分是未確定臨床意義或反映某種傳染病存在的一種寡克隆-球蛋白血癥,也是臨床上某些疾病過程的組成部分,如

13、B-細胞淋巴瘤,使用化學免疫抑制劑,自身免疫或免疫復合物病等的線索.2.免疫堿法(Immunosubtraction)鑒別單克隆蛋白的特征,用特異的抗同型免疫球蛋制品(IgG IgA IgM Kappa Lambda)抗體包被瓊脂糖凝膠(Sepharose)球與血清樣品一起孵育,在孵育前與孵育后分別進行CE檢測,通過用特異性抗體包被的Sepharose球消除一個特殊的峰來指示是哪種單克隆成分,借此對免疫球蛋白的型、亞型和輕鏈型予以鑒定和分類。3血紅蛋白成分的分析。用等電聚焦毛細管電泳（CIEF）和區(qū)帶電泳（CZE）可分離出十幾種Hb變異鏈，有作者采用CZE法對正常人和地中海貧血患者血液樣品在P

14、H11.8堿性磷酸鹽緩沖液(PBS)中進行分離 ,分離的速度很快(8min）,兩者的電泳圖譜明顯不同,對胎兒紅細胞處理后,分離其血紅蛋白,可分離出、和球蛋白鏈，和C幾種球蛋白鏈，如采用低pH3.2的緩沖液,雖然分析時間延長,但變異體的分辨效果更佳,顯然CE技術(shù)對鑒別診斷血紅蛋白病起重要作用.4.肌紅蛋白分析.在急性心肌梗死后患者的血甭和尿液中常出現(xiàn)的肌紅蛋白異常升高,低濃度肌紅蛋白難以用免疫比濁法測定,CZE可在8分鐘內(nèi)快速分離尿中低濃度肌紅蛋白并與血紅蛋白相鑒別.5.脂蛋白分析.可將血漿脂蛋白分離出14個亞組份,如在分離緩沖液中加入表面活性劑,可在短時間內(nèi)對兩個主要組份:高密度脂蛋白(HDL

15、)和低密度脂蛋白(LDL)進行定量,對LDL進一步分離為三個亞組份:LDL,中密度脂蛋白(ILD)和極低密度脂蛋白(VLDL),并對各組份的比例進行推算,從而對脂蛋白異常提供不同脂肪代謝的信息.6.糖化血紅蛋白(HbAlc)分析.CE能分離幾種糖蛋白的糖基構(gòu)型,可鑒別糖化血紅蛋白A1、Alc和其他異構(gòu)體，對糖尿病的監(jiān)控具有重要意義。7同功酶的分離，應(yīng)用HPLC技術(shù)對多種同功酶進行了成功的分離，其原理是先將樣品在毛細管中電泳分離，待形成同功酶分離區(qū)帶后，切斷電源，再加入含底物的液體緩沖液，酶可催化底物而顯色，形成右檢測的同功酶區(qū)帶，再重新接通電源，繼續(xù)電泳，使同功酶形成的染色區(qū)帶先后通過檢測器，

16、測定最大吸收外的光密度值，因此被分離同功酶可被分析并測定，如檢測b-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的A、B同工酸、淀粉酶P（胰）和S（唾液）型、肌酸磷本激酶、堿性磷酸酶、蛋白水解酶、-谷氨酰胺基轉(zhuǎn)肽酸、激肽釋放酶、血管緊張素還原酶、組織蛋白酶B和5核苷酸酶等，均可采用HPCE技術(shù)分離其同功酶。8免疫復合物分析。CE可將免疫復合物從結(jié)合的抗原抗體中迅速分離出來，應(yīng)用熒光標記單克隆抗體，經(jīng)L功F-CE檢測限可達毫克量，可用于混合液體中低濃度的免疫復合物鑒定。9DNA片段和染色體分析。HPCE分離DNA分子需多聚物交聯(lián)劑如聚丙酰稀胺，聚乙二醇、甲基纖維素等材料添加到緩沖液中作為分子篩，可對窄范圍DNA高效分

17、離，有作者應(yīng)用HPCE適應(yīng)X連鎖隱性遺傳病，成功地對DNA限制片段進行了基因多態(tài)性分析。研究表明HPCE可用于分析攜帶者及胎兒產(chǎn)前診斷，目前，CE可分離3個bpDNA片段，若分析較大分子DNA片段，當然HPCE分析DNA片段尚有許多技術(shù)需要完善，其中最為突出的問題是選擇合適的交聯(lián)劑，提高現(xiàn)有方法的分辨率，成為分析基因組的有效工具。10在治療藥物監(jiān)測中的應(yīng)用。CE可簡便快速分析生物樣品中各種形式的藥物成分，在藥理學研究，法醫(yī)學檢查及臨床毒理等方面也有廣泛應(yīng)用。如：抗腫瘤藥物氨甲蝶呤先經(jīng)固相萃取，HPCE分離后用激光激活熒光檢測器測定，其檢測限可達0.11nmol/L;抗白血病藥物孢嘧啶-D阿拉作

18、糖苷,經(jīng)簡單有機溶劑提取樣品,檢測限為8umol/L;應(yīng)用篩孔電動毛細管電泳(MECC)可監(jiān)測類抗高血壓藥物(furopyr功d功ne),在分離液中加入SDS和-環(huán)糊精.經(jīng)有機溶劑提取,最低檢測限為10ug/L在臨床常規(guī)用藥的檢測方面.如抗生素類藥物阿莫西林可以不需進行樣品的前處理,直接參與以血漿樣品進樣,但緩沖液中加入SDS可減少蛋白的管壁吸附;頭孢類抗生素(Cef功x功me)經(jīng)口服可被胃腸菌分解為五種代謝產(chǎn)物,其最終產(chǎn)物由尿液排泄,檢測其血和尿藥物濃度可作為臨床觀察指標;有的藥物分析用其血和尿藥物濃度可作為臨床觀察指標;有的藥物分析用MECC可直接分離,不必特殊處理,如平滑肌解痙藥(flavoxate).能緩解泌尿結(jié)石患者的疼痛.取患者尿液作MECC測定,檢測限可達200ug/L.止喘藥(theophyll功ne)為治療哮喘,早產(chǎn)兒窒息的常用藥,取血清,唾液和尿液樣品,以直接進樣多波長測定,其線性范圍為0200umol/L,濃度在5110范圍時有較好的精確度.催眠鎮(zhèn)靜類藥物臨床應(yīng)用范圍廣,品種多,易發(fā)生藥物依賴性,且中毒劑量與治療劑量接近.如需進行藥物濃度監(jiān)測,最低檢測限可達ng/L.抗