研究捷安肽素抗真菌作用機理

1、研究捷安肽素抗真菌作用機理    【摘要】  目的 研究捷安肽素的抗真菌作用機理。方法 采用形態(tài)學(xué)方法和同位素標(biāo)記法。顯微形態(tài)觀察經(jīng)捷安肽素處理后的供試真菌的形態(tài)學(xué)變化。進一步采用14C同位素標(biāo)記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對真菌(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性反應(yīng)的影響。結(jié)果 顯微形態(tài)觀察表明，經(jīng)捷安肽素處理后，供試真菌呈現(xiàn)球形膨脹，而且隨著捷安肽素作用強度增強，球形膨脹的程度和發(fā)生頻率也增加，提示捷安肽素的作用位點在真菌細胞壁。同位素標(biāo)記實驗表明，捷安肽素可抑制（1,

2、3）-D-葡聚糖合成酶的活性，降低真菌細胞壁合成過程中（1,3）-D-葡聚糖的放射性摻入，對疫霉菌和辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的抑制率分別達到77.7%和77.5%。結(jié)論 捷安肽素的抗真菌作用機理為：抑制細胞（1,3）-D-葡聚糖合成酶的活性，破壞真菌細胞壁的合成，造成真菌細胞壁組分（1,3）-D-葡聚糖的缺損和病原真菌生長抑制。  【關(guān)鍵詞】  捷安肽素；抗真菌作用機理；（1,3）-D-葡聚糖合成酶     Abstract：Objective To inve

3、stigate the antifungal mechanism of Jiean-peptide.Methods The mode of action of Jiean-peptide against 4 phytopathogenic filamentous fungi associated with phytopathy:Phytophthora sp.,Colletotrichum

4、0;gossypii,Southw Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum was investigated by the method of morphology and isotope labelling.The (1,3)-D-glucan synthase assay was processed 

5、using isotope labelled substrateurdine diphosphate(14C)glucose to study the effect of Jiean-peptide on fungal(1,3)-D-glucan synthase.Results Micrographic observation revealed that the Jiean-peptide ma

6、de the hyphal expanded and globular.The(1,3)-D-glucan synthase assay showed Jiean-peptide could inhibit the activity of(1,3)-D-glucan synthase and reduce the radioactivity incorporation of(1,3)-D

7、-glucan.The inhibition percentages of Jiean-peptide against Phytophthora sp.and Colletotrichum gossypii Southw were 77.7% and 77.5% respectively.Conclusion The antifungal mechanism of Jiean-peptide

8、60;was the inhibition of enzyme activity of(1,3)-D-glucan synthase.     Key words:Jiean-peptide；antifungal mechanism；(1,3)-D-glucan synthase       捷安肽素是一種由芽孢桿菌產(chǎn)生的抗真菌活性多肽，具有廣譜抗真菌活性，而且穩(wěn)定性好、抑菌持

9、久，具有很好的開發(fā)前景1，2。從捷安肽素對疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌等多種常見重要植物病原真菌的抑菌性能可知，捷安肽素可以通過抑制真菌孢子萌發(fā)、菌絲生長而發(fā)揮抗真菌生長作用。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，捷安肽素可以破壞真菌的細胞壁結(jié)構(gòu)，使真菌細胞呈現(xiàn)原生質(zhì)球狀3。（1,3）-D-葡聚糖合成酶（EC2.4.1.34；尿苷二磷酸-葡萄糖/(1,3)-D-葡聚糖-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶）是一細胞膜結(jié)合酶，在細胞膜內(nèi)側(cè)聚合UDPG形成葡聚糖纖維，葡聚糖纖維分泌出細胞膜形成網(wǎng)狀支架，對真菌細胞壁的完整性及保護真菌抵抗低滲透壓起重要作用4，5。本文作者采用形態(tài)學(xué)方法和同位素標(biāo)記法研究捷安肽素對真菌細胞壁及其（

10、1,3）-D-葡聚糖合成酶的作用，進一步深入探討捷安肽素的抗真菌作用機理，為捷安肽素的進一步開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。     1  材料     1.1  菌種     疫霉菌（Phytophthora sp.）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum gossypii Southw）、灰霉菌（Botrytis cinerea）、棉花枯萎病菌（Fusarium 

11、;oxysporum f.sp.vasinfectum），均為本實驗室保藏菌種。     1.2  培養(yǎng)基     馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基。     1.3  主要試劑     捷安肽素原液（生物效價為19.5 mm）由本實驗室提供；尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖UDP-（14C）-G，Perkin-Elmer進口產(chǎn)品；2,5-二苯基&#

12、160; 唑（2,5-Di-phenyloxazole,PPO），F(xiàn)isher進口產(chǎn)品。（捷安肽素的生物效價采用管碟法2測定，以疫霉菌為檢驗菌株，以抑菌圈直徑為效價指標(biāo)）。     1.4  主要溶液     粗酶提取緩沖液5×10-2mol/L Tris-HCl pH7.5,1mol/L葡萄糖，1×10-3mol/L EDTA，5×10-3mol/L MgCl2,1×10-2mol/L

13、 NaF,層析展開劑95%乙醇,1mol冰醋酸（73，V/V）,閃爍液1g PPO，200 ml甲苯。     1.5  主要儀器     SHZ-82大容量回旋振蕩器  德國ZAISS,AXIOPLAN2型多功能顯微鏡,PHS-3精密數(shù)顯酸度計Sigma 3K30高速冷凍離心機,FJ-353G1型雙道液體閃爍計數(shù)器等。     2  方法

14、0;2.1  捷安肽素作用下供試菌的形態(tài)觀察     將疫霉菌、辣椒炭疽病菌、灰霉菌、棉花枯萎病菌接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基(終孢子濃度為106個/ml)，25150 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。每隔2 h取樣，用0.05%的乳酚藍染色液對樣品進行固定、染色、顯微觀察孢子萌發(fā)情況和菌絲生長情況。設(shè)置3個實驗組，捷安肽素的處理濃度分別為原液濃度、1/2原液濃度和空白對照。     2.2  捷安肽素樣品的處理  

15、   將捷安肽素樣品分為兩組，組不做任何處理,生物效價為19.5 mm；組用30%的NaOH調(diào)pH為10，再以15%的HCl調(diào)pH為7.5，生物效價為零。     2.3  制備（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液     分別接種疫霉菌和辣椒炭疽病菌于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，疫霉菌30、150 r/min振蕩培養(yǎng)30 h；辣椒炭疽病菌25、150 r/min振蕩培養(yǎng)36h,收集培養(yǎng)液，離心洗滌獲得菌絲體。

16、(1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備采用文獻6的方法，經(jīng)適當(dāng)改進。液氮研磨菌絲體后加入粗酶提取緩沖液，充分振蕩混勻于4、3 500g離心10 min。收集上清夜，再將上清液于4、50 000g離心45 min。所得沉淀為粗酶制品,懸浮于503×103mol/L Tris-Hcl pH 7.5（含33%的甘油）中，用Bradford法測定酶蛋白含量，蛋白濃度控制在35 g/l,于-70保存?zhèn)溆谩?#160;    2.4  （1,3）-D-葡聚

17、糖合成酶粗酶的活性測定    采用14C標(biāo)記的特異底物UDPG，與(1,3)-D-葡聚糖合成酶進行酶反應(yīng)，閃爍計數(shù)檢測反應(yīng)產(chǎn)物(1,3)-D-葡聚糖的放射性，確定(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的活性。     2.4.1  (1,3)-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)7     反應(yīng)體系40l，包括253×103mol/L Tris-HCl pH7.5,0.5 mol/L葡萄糖，103×103m

18、ol/L NaF,5 mg/ml BSA,740 Bq UDP-（14C）-G和10 l(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液。以加入10 l雙蒸水的反應(yīng)組作為(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的空白對照組，以加入10 l沸水浴30 min滅活的粗酶液的反應(yīng)組作為(1,3)-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰性對照組。每組反應(yīng)重復(fù)2次。反應(yīng)系統(tǒng)于30保溫30 min，最后加入4 l冰乙酸終止反應(yīng)。     2.4.2  (1,3

19、)-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)產(chǎn)物的分離和放射性測定    反應(yīng)終止后，按文獻8的方法進行反應(yīng)產(chǎn)物的分離。將反應(yīng)液點樣于新華3號濾紙上，下行層析過夜。取出濾紙風(fēng)干，剪下原點，于FJ-353G1型雙道液體閃爍計數(shù)器測定每分鐘閃爍次數(shù)（Cpm），表示同位素標(biāo)記的(1,3)-D-葡聚糖的放射性強度，并以此衡量(1,3)-D-葡聚糖合成酶的活性。FJ-353G1型雙道液體閃爍計數(shù)器對C14探測效率大于70%；閃爍液放射本底小于60 次/min。     2.5  捷安肽素對（1,3）-D-

20、葡聚糖合成酶反應(yīng)的影響    按2.3方法進行捷安肽素影響下的(1,3)-D-葡聚 糖合成酶反應(yīng)和產(chǎn)物分離與放射性檢測。反應(yīng)設(shè)置3組：捷安肽素處理組、捷安肽素處理組和捷安肽素空白對照組。實驗中捷安肽素或雙蒸水加樣量均為2l，每組重復(fù)10次。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物的放射性計算產(chǎn)物的放射性摻入率和捷安肽素對酶反應(yīng)的抑制率。摻入率=處理組產(chǎn)物放射性/對照組產(chǎn)物放射性×100%，抑制率=1-摻入率。2.6  數(shù)據(jù)處理     采用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5進行數(shù)據(jù)的單因素方差分析。

21、     3  結(jié)果與分析     3.1  捷安肽素對各病原菌形態(tài)的影響     光學(xué)顯微鏡觀察捷安肽素作用下各病原真菌的菌絲和孢子形態(tài)（0.05%的乳酚藍染色液染色），可見供試真菌的孢子和菌絲形態(tài)有顯著的變化，孢子和菌絲體膨大、畸形、原生質(zhì)凝聚、孢子不萌發(fā)或萌發(fā)異常、菌絲上產(chǎn)生大量球形膨脹泡囊、生長受阻。隨著捷安肽素處理的時間增長或濃度加大這種球形膨脹的程度和發(fā)生頻率也增大。圖1所示為培養(yǎng)24h的供試病

22、原真菌,捷安肽素處理濃度為1/2原液濃度，其中對照菌絲表面光滑、結(jié)構(gòu)完整，處理菌絲均呈現(xiàn)不同程度的球形膨脹。眾所周知，真菌的細胞壁是細胞規(guī)范和維持形態(tài)所必需的,一旦細胞壁受損，細胞的原生質(zhì)體在胞內(nèi)滲透壓的作用下，便會形成球狀。由此推測捷安肽素破壞了供試真菌的細胞壁，從而使之呈現(xiàn)球形膨脹。     3.2  （1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的制備和活性    采用2.3方法制備出疫霉菌和辣椒炭疽病菌菌絲的（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液，經(jīng)檢驗該（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶液的陰

23、性對照組與空白對照組結(jié)果相同，反應(yīng)產(chǎn)物的放射性均小于60 Cpm，為閃爍液本底值，沒有酶活；實驗組反應(yīng)產(chǎn)物的放射性為3 0005 000 Cpm，表明（1,3）-D-葡聚糖合成酶粗酶具有催化活性，可用于進一步的實驗。     3.3  捷安肽素對（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)的影響    按照方法2.5，采用14C同位素標(biāo)記的特異底物“UDP-（14C）-G”示蹤，用捷安肽素      

24、;     處理（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)，測定反應(yīng)產(chǎn)物（1,3）-D-葡聚糖的放射性。結(jié)果表明疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，處理組、的放射性摻入（%空白對照）分別為22.3%±2.8%和96.0%±0.8%；辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，處理組、的放射性摻入（%空白對照）分別為22.5%±2.5%和74.7%±3.0%，見圖2。     圖2  捷安肽素對（1,3）-D-葡聚糖放射性摻入的影響

25、60;    Fig.2  The effects of Jiean-peptide on(1,3)-D-glucans radioactive incorporation     如圖2所示，在疫霉菌和辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組、的放射性摻入均低于空白對照組，但其各自的組間差異不同。進一步采用統(tǒng)計分析軟件SPSS11.5對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，比較組間差異是否顯著，結(jié)果見表1和表2。表

26、1  捷安肽素對疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影響從表1可知，疫霉菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組和處理組之間、捷安肽素處理組和空白對照組之間均差異顯著（P10.01,P20.01,n=10），處理組和空白對照組之間差異不顯著（P30.05,n=10），表明捷安肽素處理組可抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率為77.7%±2.8%；捷安肽素處理組不能抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率4%±0.8%屬于實驗誤差，不具有統(tǒng)計意義。表2  捷安肽素對辣椒炭疽病菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶的影響從表2可知，辣椒炭疽病菌（

27、1,3）-D-葡聚糖合成酶反應(yīng)中，捷安肽素處理組、處理組、空白對照組相互之間均差異顯著（P10.01，P20.01, P30.01,n=10），表明捷安肽素處理組和捷安肽素處理組均可抑制反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入，抑制率分別為77.5%±2.5%和25.3%±3.0%。     在本實驗中，捷安肽素處理組(效價為19.5mm)對辣椒炭疽病菌和疫霉菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶均具有抑制作用，這與它擁有生物活性的特性相一致。而捷安肽素處理組的效價為零，即沒有生物活性，但它對辣椒炭疽病菌的（1,3）-D-葡聚糖合成酶卻表現(xiàn)

28、出了抑制作用。分析原因可能是因為捷安肽素的生物效價測試菌為疫霉菌，捷安肽素?zé)o生物活性只是相對疫霉菌而言。而辣椒炭疽病菌對捷安肽素的敏感性不如疫霉菌對捷安肽素的敏感性高3，所以對于同一濃度捷安肽素處理，辣椒炭疽病菌的酶反應(yīng)受抑，疫霉菌的酶反應(yīng)不受抑制。     4  討論     隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，放射性核素正廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等學(xué)科的各個領(lǐng)域，大大地推動這些學(xué)科進入分子水平的新階段。酶的放射性分析方法9即是采用放射性標(biāo)記底物與酶液在適宜的條件下保溫一段時

29、間后，分離、測定酶催化底物所生成的產(chǎn)物的放射性而確定酶活性，是生物研究中最常用的方法。其它細胞壁相關(guān)酶類的分析法包括生物化學(xué)法、原位分析法、熒光染色等，但都不如放射性分析方法靈敏、快速、簡便。因此，本實驗采用酶的放射性分析方法研究捷安肽素的抗真菌作用機理：從疫霉菌和辣椒炭疽病菌中提取細胞壁合成中重要的（1,3）-D-葡聚糖合成酶，采用14C放射性標(biāo)記的特異底物“尿苷二磷酸-（14C）-葡萄糖”示蹤，研究捷安肽素對(1,3)-D-葡聚糖合成酶活性的影響。     已知抗真菌多肽的作用機理主要有兩種10：一種是干擾真菌的細胞壁組分葡聚糖、幾丁質(zhì)和各

30、種甘露蛋白的合成，導(dǎo)致細胞壁的缺損。如棘白霉素類化合物能結(jié)合-1,3-D-葡聚糖合成酶復(fù)合體的Fksp亞基而干擾-1,3-D-葡聚糖的合成，發(fā)揮抗真菌作用11。另一種是在細胞膜上形成電勢依賴的或其它的通道，改變細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)容物泄露。陳剛、裴炎等通過檢測抗真菌多肽APS對脂質(zhì)平面膜電學(xué)性質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)APS可在細胞膜上持續(xù)形成孔道（pores），破壞膜的完整性，引起細胞內(nèi)容物的外流，最終導(dǎo)致真菌的死亡12。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，捷安肽素可使疫霉菌和辣椒炭疽病菌的-1,3-D-葡聚糖合成酶的反應(yīng)產(chǎn)物的放射性摻入率降低。由此推測捷安肽素可能的抗真菌機理是：抑制真菌（1,3）-D-葡聚糖合成酶活性

31、，造成真菌細胞壁組分（1,3）-D-葡聚糖的缺損，破壞真菌細胞壁的完整性，造成病原真菌生長抑制。真菌的細胞壁合成是一個非常復(fù)雜的過程，涉及許多酶類13，捷安肽素對真菌細胞壁合成相關(guān)的其它酶類如幾丁質(zhì)合成酶等的酶活性有無作用還有待進一步研究。     植物真菌病害是目前較難防治的農(nóng)作物病害，一直制約著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展。而過度地大量使用化學(xué)農(nóng)藥，已造成了全球生態(tài)環(huán)境的不斷惡化及糧食危機，發(fā)展無公害生物農(nóng)藥已是大勢所趨。捷安肽素抗真菌作用機理的初步闡明，有助于捷安肽素作用機理的更深層次的研究，有助于建立農(nóng)用抗菌素的篩選模型、利用分子設(shè)計手段進行分子的改

32、造和新的抗菌物質(zhì)的合成，同時為捷安肽素開發(fā)為新型生物農(nóng)藥提供生產(chǎn)、制劑、使用等方面的理論依據(jù)。同時，因為動物細胞沒有細胞壁，捷安肽素對真菌細胞壁合成的抑制作用，為捷安肽素向人藥發(fā)展提供了可能。 【參考文獻】   1ZHONG Juan,ZHOU Jinyan,TANG Hong.Mutation Breeding of a Strain Producing High-yield Jiean-peptide,an Antifungal P

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