五味子醇甲對KC介導的肝纖維化抑制作用的初步研究

1、五味子醇甲對KC介導的肝纖維化抑制作用的初步研究 08-10-13 10:17:00 編輯：studa20 作者：王洋, 戚好文，胡詠武, 王勝春【摘要】 目的: 觀察五味子醇甲（SCH）對肝纖維化大鼠枯否細胞（KC）釋放活性介質的影響.方法: 分離、純化大鼠KC細胞并建立脂多糖 (LPS)誘導KC細胞釋放細胞因子（TNF，IL6, IL8）模型；制備及采用I125放射免疫法分別測定正常對照組、LPS模型組及SCH治療組的細胞因子水平；酶譜法檢測細胞培養(yǎng)上清谷草轉氨酶(AST), 谷丙轉氨酶(ALT)的變化. 結果: SCH治療組可抑制KC細胞分泌TNF(21.26.3), IL6(0.170

2、.01), IL8(0.80.1)等細胞因子（P0.05）. 結論: SCH甲具有治療肝纖維化的作用. 【關鍵詞】 五味子醇甲；脂多糖；枯否細胞；細胞因子；抑制【Abstract】 AIM： To observe the effect of schizandrin(SCH) on cytokines released by kupffer cells in rats with hepatic fibrosis. METHODS: Kupffer cells were separated, purified and induced to release cytokines (TNF, IL6,

3、IL8) by lipopolysaccharide(LPS). Cytokines of control group，LPS group and SCH treatment group were prepared and separately measured by 125I radioimmunoassay. Alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) of hepatocyte supernatant were determined with zymography. RESULTS： SCH si

4、gnificantly inhibited kupffer cells from delivering TNF(21.26.3), IL6(0.1780.01), IL8(0.80.1) (P0.05). CONCLUSION： Schizandrin can be used to treat hepatic fibrosis.【Keywords】 schizandrin; lPS; kupffer cell; cytokine; inhibiting0 引言 中藥治療肝炎、肝硬化具有其獨到之處，因此長期以來是該領域的研究熱點. 五味子為木蘭科植物五味子的干燥成熟果實. 具有斂肺滋腎、生津斂汗

5、、澀精止安、寧心安神的功效1. SCH（schizandrin，SCH）為五味子醇提取物，對化學毒物引起的動物肝細胞損傷有明顯保護作用, 在治療急慢性肝炎方面具有顯著療效. 但五味子醇甲對肝硬變的防治作用目前尚未見報道. 已知細胞因子在肝硬變發(fā)生發(fā)展中起著重要作用, 為此本研究針對肝硬變的特點，進行了體外五味子醇甲對大鼠肝枯否細胞（kupffer cell，KC）分泌腫瘤壞死因子 (TNF), 白細胞介素6 (IL6)與白細胞介素8(IL8)等活性細胞因子影響的研究. 旨在初步揭示SCH抗肝纖維化的作用.1 材料和方法1.1 材料 精密稱取1 mg SCH，加DMSO 0.1 mL（sigma

6、公司）溶解后，用4 mL含100 mL/L小牛血清培養(yǎng)液混勻，過濾除菌，即為200 mg/L溶液. 受試藥物濃度為100 mg/L（預實驗證實）.1.2 方法1.2.1 枯否細胞分離與培養(yǎng) 參照文獻2方法，取體質量150200 g，SD雌性大鼠3只（第四軍醫(yī)大學動物中心提供），250 g/L烏拉坦麻醉后，小心游離摘取肝臟（勿使肝包膜破裂），置入Hanks液的培養(yǎng)皿中反復沖洗3次，剝離肝包膜，剪碎肝臟，過220目細胞篩，細胞用無血清培養(yǎng)液沖洗，混懸后1000 r /min, 離心5 min，棄去上清；沉淀細胞用無血清培養(yǎng)液洗滌，1000 r/ min離心2次, 每次5 min，細胞重懸于200

7、mL/L小牛血清培養(yǎng)液中，混勻后滴加于不連續(xù)梯度密度分離液上(1.053, 1.058, 1.080)，5200 g（20）離心20 min. 小心吸取密度1.058以下分離液，收集的分離液3000 r/min離心10 min, 沉淀細胞用200 mL/L小牛血清培養(yǎng)液洗滌，3000 r/ min離心2次, 每次10 min，4 g/L臺盼藍染色判斷活性. 細胞重懸于200mL/L小牛血清培養(yǎng)液中，調整細胞密度11011個/L后，接種于培養(yǎng)瓶內, 37, 50 mL/L CO2孵箱內培養(yǎng)，經(jīng)反復傳代純化后開始試驗.1.2.2 建立脂多糖 (LPS)誘導KC細胞釋放細胞因子（TNF，IL6, I

8、L8）的模型 4組KC細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，37, 50 mL/L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h使細胞貼壁，每組分別用100, 80, 60, 40 g/L的脂多糖（lipopolysacchide，LPS，SIGMA公司）孵育6, 12, 18, 24 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1次；每孔加濃度5 g/L的MTT染液20 L（溶于PBS中，濾過除菌，4避光保存）于37，50 mL/L CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育細胞46 h；加入新鮮配制的DMSO溶解MTT 150 L/孔，水平搖床上搖10 min，使還原產物充分溶解，酶標儀上570 nm波長下測定光密度值. 每試驗點

9、重復4孔，優(yōu)選出LPS作用KC細胞的最佳濃度及培養(yǎng)時間，據(jù)此最佳條件建立LPS誘導KC細胞釋放細胞因子的模型.1.2.3 實驗分組及各組細胞因子（TNF，IL6，IL8）檢測 取24孔培養(yǎng)板2塊，每孔加入8 mm8 mm玻片1張后接種純化KC細胞懸液1 mL（每mL含細胞數(shù)約1108），置37，50 mL/L CO2孵箱內培養(yǎng)，待細胞長成單層后分設正常對照組、LPS模型組、SCH治療組，每組8孔. 正常組、LPS模型組加完全培養(yǎng)液；SCH治療組加入濃度為100 mg/L的供試液1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清后正常組加完全培養(yǎng)液；LPS組、SCH治療組各加60 g/L LPS的完全培養(yǎng)液1

10、 mL，繼續(xù)培養(yǎng)8 h，收集各組細胞上清至-80保存，I125測定各組細胞培養(yǎng)上清中細胞因子TNF, IL6及IL8的含量.1.2.4 SCH對細胞因子介導的肝損傷的作用 按“1.2.1”方法制備KC細胞，調整細胞密度11011/L，置雙層培養(yǎng)小室下層，37, 50 mL/L CO2孵箱內培養(yǎng)，長至單層后進行實驗. 取生長良好細胞分成3組：正常對照組、LPS模型組及SCH組. 正常對照組、LPS模型組. 制備方法同1.2.3. SCH組制備方法為生長良好KC細胞, 用SCH供試液（100 mg/L）培養(yǎng). 培養(yǎng)12 h棄上清，正常對照組加完全培養(yǎng)液，LPS模型組和SCH組每孔各加60 g/L

11、LPS供試液1 mL，培養(yǎng)3 h后終止. 制備鼠肝細胞（HC）懸液，按密度11011/L加入上述各組培養(yǎng)小室上層內，每組6孔，每孔0.5 mL，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后取上清液測定谷草轉氨酶(AST), 谷丙轉氨酶(ALT). 統(tǒng)計學處理: 使用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件，實驗結果以 表示，組間比較采用單因素方差分析及LSDt檢驗， P0.05為差異具有統(tǒng)計學意義. 08-10-13 10:17:00 編輯：studa202 結果2.1 不同濃度LPS 對KC細胞活性的影響 MTT結果顯示使用濃度為60 gL的LPS孵育KC細胞培養(yǎng)12 h 時，KC活性最佳(圖1).圖1 不同濃度LPS對KC細胞活

12、性影響（略）2.2 SCH對KC細胞分泌TNF，IL6，IL8的影響 與正常對照組相比，LPS模型組KC細胞培養(yǎng)上清中細胞因子水平升高(P0.05)，SCH治療組KC細胞培養(yǎng)上清TNF和IL8水平較LPS模型組下降(P0.05, 表1).表1 KC細胞上清中細胞因子的水平（略）aP0.05 vs 正常對照；bP0.01 vs LPS模型.2.3 SCH對肝細胞培養(yǎng)上清AST，ALT的影響 與正常對照組相比，LPS模型組HC細胞培養(yǎng)上清AST和ALT水平升高（P0.05），SCH治療組HC細胞培養(yǎng)上清TNF和IL8水平較LPS模型組下降（P0.05），接近正常對照組水平 (表2).表2 復層培養(yǎng)

13、條件下HC細胞上清中AST, ALT水平（略）aP0.05, bP0.01 vs SCH. AST：谷草轉氨酶；ALT：谷丙轉氨酶；LPS：脂多糖；SCH：五味子醇甲.3 討論 現(xiàn)有研究表明在多種因素誘發(fā)的肝損害過程中，均有激活的肝枯否細胞的介導及參與. KC細胞釋放TNF，IL和蛋白水解酶等細胞因子，是該過程中的重要病理機制. 高水平的TNF可以誘導肝細胞凋亡3與壞死，TNF尚能誘導KC產生自由基，對肝竇內的中性粒細胞具有趨化作用而進一步加重肝細胞損傷4. 此外，TNF又可誘導單核細胞和巨噬細胞產生IL8和IL6 5-7. IL-6刺激肝細胞、枯否細胞分泌多種細胞因子，引發(fā)這些細胞因子的致纖

14、維化作用. 在感染、局部缺血、創(chuàng)傷及其它肝組織內環(huán)境失衡條件下，IL8的重要誘導劑TNF增高，導致IL8產生增多，直接損害肝細胞和加速病情惡化. SCH為五味子醇提取物，對化學毒物引起的動物肝細胞損傷有明顯保護作用8，但對肝硬變細胞因子的影響尚未見報道. 本研究首先建立脂多糖誘導大鼠肝枯否細胞釋放細胞因子（TNF，IL6,IL8）模型，通過測定并比較正常組、LPS組和SCH治療組的細胞因子，結果發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，LPS模型組KC細胞培養(yǎng)上清TNF和IL8水平升高（P0.05)，表明KC細胞經(jīng)適宜濃度（60 gL）LPS誘導12 h后活性細胞因子的分泌增加，從而建立了本研究所需的細胞模型.

15、另一方面，SCH治療組KC細胞培養(yǎng)上清TNF和IL8水平較LPS模型組下降（P0.05），IL6有下降趨勢，提示SCH干預能減少KC細胞活性因子的釋放，但IL6水平降低不具備統(tǒng)計學差異，可能與因子調控的不同步性及LPS作用KC時間和所選濃度（60 gL）有關. 在上述模型的基礎上，進一步研究了細胞因子介導的肝細胞（HC）培養(yǎng)上清AST，ALT的變化. 結果是LPS模型組HC細胞培養(yǎng)上清AST和ALT水平高于正常對照組， 證實LPS誘導的KC釋放活性介質確對體外培養(yǎng)肝細胞有損害作用. SCH治療組HC細胞培養(yǎng)上清AST和ALT水平較LPS模型組下降，接近正常對照組水平，提示經(jīng)SCH預處理的KC細

16、胞具有抵抗LPS、減少肝纖維化因子損害及保護肝細胞的作用. 已有實驗表明肝纖維化患者的纖維化程度改善與IL6,IL8血清水平降低成正相關9；Pena等10發(fā)現(xiàn)經(jīng)過還原型谷胱甘肽治療的肝纖維化患者血清中IL6 和IL8 水平明顯下降；Sener等11研究指出銀杏治療膽梗阻大鼠肝纖維化時，相比于正常組，治療組TNF水平明顯降低. 本研究初步提示SCH通過抑制枯否細胞釋放TNF，IL6，IL8來保護肝細胞及減少肝損害的作用. 鑒于肝硬化病變機制復雜，SCH對肝臟的保護作用有待深入探討.【參考文獻】 1 趙永德，崔惠玲，李 娟. 五味子的藥理作用及臨床應用J. 中華臨床醫(yī)藥與護理，2005, 3:41

17、-42.2 Feng JM, Shi JQ, Liu YS, et al. Isolation, culture and identification of Kupffer cells from rat liverJ. Acta Acad Med Mil Tert, 2002, 24:223-224.3 Ding WX, Yin XM. Dissection of the multiple mechanisms of TNFalphainduced apoptosis in liver injuryJ. J Cell Mol Med, 2004, 8:445-454.4 MolorErdene

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