糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜屏障的保護(hù)課件

1、糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸粘膜屏障的保護(hù)課件選題依據(jù)選題依據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新研究方案研究方案研究計(jì)劃及預(yù)算研究計(jì)劃及預(yù)算選選 題題 依依 據(jù)據(jù) 糞菌移植 炎癥性腸病 腸粘膜屏障糞菌移植 糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將健康人糞便中的功能菌群移植到菌群分布異常的患者胃腸道內(nèi)，重建其健康的菌群分布結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)腸道及腸道外疾病恢復(fù)的一種治療方式。在世界醫(yī)學(xué)史上至少始于公元4世紀(jì)，但是直到近幾年才得到了恢復(fù)的一種治療方式。FMT在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的概念包括4個(gè)層面的含義：(1)從健康捐贈(zèng)者糞便中分離功能菌群；(2)移植到患者消化道；

2、(3)重建患者腸道菌群狀態(tài)；(4)目的在于治療腸內(nèi)外疾病。炎癥性腸病炎癥性腸病 炎癥性腸病炎癥性腸病inflammatory bowel diseases inflammatory bowel diseases IBD IBD 是一組病因未明的累及胃腸道的慢性炎癥性是一組病因未明的累及胃腸道的慢性炎癥性疾病包括潰瘍性結(jié)腸炎疾病包括潰瘍性結(jié)腸炎u(yù)lcerative colitis UCulcerative colitis UC和克羅恩病和克羅恩病Crohns diseasesCDCrohns diseasesCD。近年來(lái)發(fā)病率。近年來(lái)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)呈逐年上升趨勢(shì) 其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，

3、與其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，與遺傳環(huán)境微生物免疫等多種因素密切相關(guān)。遺傳環(huán)境微生物免疫等多種因素密切相關(guān)。腸粘膜屏障 腸黏膜是機(jī)體中一處最大的黏膜表面,它不但是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要場(chǎng)所，同時(shí)也是人體最大的細(xì)菌儲(chǔ)存器官和病原微生物、毒素侵入機(jī)體的主要門戶。腸黏膜屏障是指由機(jī)械屏障、生物屏障、免疫屏障等組成的一個(gè)復(fù)雜而又龐大的立體防御體系，其主要作用是能夠有效地阻止腸道內(nèi)的有害物質(zhì)如細(xì)菌和毒素穿過(guò)腸粘膜進(jìn)入人體內(nèi)其他組織、器官和血液循環(huán)，使機(jī)體內(nèi)環(huán)境保持相對(duì)穩(wěn)定, 維持機(jī)體的正常生命活動(dòng)。 當(dāng)各種原因引起腸黏膜損傷、萎縮、腸道通透性增加或腸道菌群失調(diào)時(shí)，就容易導(dǎo)致腸道細(xì)菌易位和(或)腸源性內(nèi)毒素

4、血癥，從而誘發(fā)或加重全身炎性反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)或引起多器官功能衰竭(multiple organ failure, MOF) 形成惡性循環(huán)。近期的研究表明：炎性腸?。↖BD）病人腸黏膜對(duì)腸道內(nèi)共生菌群不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)是導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。盡管還沒(méi)有確定哪一種菌對(duì)腸黏膜免疫屏障有影響，但目前的研究發(fā)現(xiàn)IBD病人腸道內(nèi)菌群的數(shù)量和豐度都較正常人低國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處近年來(lái)FMT在治療復(fù)發(fā)性腸道艱難梭狀芽孢桿菌感染中取得了很好的療效。因此，國(guó)外相繼開始采用該方法治療IBD。

5、但糞菌移植治療炎癥性腸病的研究目前正處于起步階段，尚需逐步開展針對(duì)糞菌移植治療對(duì)照研究提供更有力的依據(jù)，因此開展糞菌移植在治療炎癥性腸病中應(yīng)用的研究具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。本課題旨在評(píng)價(jià)糞菌移植對(duì)炎癥性腸病大鼠血清DAO及D-乳酸影響，研究其對(duì)大鼠腸粘膜屏障的保護(hù)作用。從而為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及創(chuàng)新之處 現(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性CDI和IBD的個(gè)案或系列病例報(bào)道,但FMT導(dǎo)致患者腸道菌群具體發(fā)生何種有益變化及其潛在的機(jī)制仍不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)在于研究糞菌移植對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸粘膜屏障的保護(hù)作用，此項(xiàng)研究目前鮮有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組

6、建立模型建立模型干預(yù)措施干預(yù)措施預(yù)期成果預(yù)期成果技術(shù)路線技術(shù)路線實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分組 健康雄性SD大鼠54只，體重250300g，隨機(jī)分為3組： （A）空白對(duì)照組 （B）模型生理鹽水組 （C）模型糞菌移植組建立模型建立模型 大鼠造模前1 d禁食24 h，不禁水，稱重后，3的戊巴比妥腹腔注射麻醉(或乙醚)，52，4，6三硝基苯磺酸(TNBS WV)按100 mgkg一150 mgkg(約等于TNBS原液O4mL06 mL相當(dāng)于200 g大鼠20 mg30 mg)；分別加入乙醇；體位為頭朝下，用聚丙烯管插入肛門上段8 cm，注射器注人。再倒立15 min左右，以防藥液溢出，UC一次性灌腸。 新鮮糞菌液

7、制備流程：將供體新鮮糞便樣本置于攪拌器中，09NaCl溶液進(jìn)行初步均質(zhì)加工（新鮮糞便與09NaCl溶液的比值為1:5）；將糞便漿體經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾去除其中的大顆粒物質(zhì)；冰上轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室并在采集后2h內(nèi)進(jìn)行處理；將樣本在氮?dú)馍锕こ虖N內(nèi)進(jìn)行稱重并在勻漿器中進(jìn)一步勻質(zhì)處理；漿體逐級(jí)經(jīng)過(guò)直徑20mm、10 mm、05mm和025mm的不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾以去除未吸收的食物殘?jiān)托☆w粒物質(zhì)；將再次過(guò)濾的樣本以6000轉(zhuǎn)min的速率離心15min，并將沉淀再懸浮于09NaCl溶液中，得幾乎無(wú)色無(wú)味的糞菌液。獲得的新鮮糞菌液可立即進(jìn)行移植，也可加入無(wú)菌甘油后置于一80作為冰凍樣本保存18周。干預(yù)措施干預(yù)措施 三

8、組大鼠按大鼠正常灌腸劑量灌入糞菌移植液及生理鹽水。A、B組給生理鹽水灌腸；C組給予糞菌移植液。飼養(yǎng)期間,于第3、7、11天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組分別取5只大鼠取血測(cè)量相關(guān)指標(biāo)，并取肛門以上8cm腸段卷起，置10中性甲醛中固定，石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察。在光鏡下觀察組織損傷程度并采用Chiu氏6級(jí)評(píng)分法評(píng)估損傷程度檢測(cè)指標(biāo)及意義檢測(cè)指標(biāo)及意義D-乳酸乳酸 D-乳酸是腸道固有細(xì)菌的代謝終產(chǎn)物，幾乎哺乳動(dòng)物機(jī)體的各種組織均不產(chǎn)生D-乳酸，也沒(méi)有代謝分解D-乳酸的酶系統(tǒng)，所以血漿中的D-乳酸基本上來(lái)源于腸道。當(dāng)腸道發(fā)生急性缺血時(shí)，局部細(xì)菌大量增殖，破壞了腸粘膜的生物屏障，由于腸缺血致腸粘膜絨毛頂

9、端上皮脫落，細(xì)胞旁路途徑增加而致腸粘膜通透性增加，此時(shí)腸道中細(xì)菌產(chǎn)生的大量D-乳酸通過(guò)受損粘膜經(jīng)循環(huán)入血，故監(jiān)測(cè)血中D-乳酸水平可及時(shí)反映腸粘膜損害程度和通透性變化。檢測(cè)指標(biāo)及意義檢測(cè)指標(biāo)及意義血漿二胺氧化酶（血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）活）活性測(cè)定性測(cè)定 DAO是腸粘膜細(xì)胞的標(biāo)志物，存在于哺乳動(dòng)物小腸絨毛上層，在其他組織和細(xì)胞中幾乎不存在，生理狀況下血漿中DAO活性很低，在腸粘膜受損時(shí)，由腸粘膜細(xì)胞釋放的DAO大量入血，使血中濃度大幅度上升。有研究證實(shí)，血漿DAO活性升高的時(shí)相早于內(nèi)毒素和D-乳酸，提示血漿DAO活性作為反映腸屏障功能損傷指標(biāo)不僅特異度強(qiáng)，靈敏度也

10、較高，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、費(fèi)用低，是反映腸粘膜結(jié)構(gòu)完整性較理想的指標(biāo)。檢測(cè)指標(biāo)及意義檢測(cè)指標(biāo)及意義 HEHE染色后光鏡觀察組織病理改變。染色后光鏡觀察組織病理改變。雄性雄性SD大鼠模型大鼠模型空白對(duì)照組空白對(duì)照組糞菌移植組糞菌移植組于于3、7、11天各處死天各處死6只大鼠只大鼠測(cè)血清指標(biāo)濃度取結(jié)腸組織測(cè)血清指標(biāo)濃度取結(jié)腸組織HE染色后光鏡觀察染色后光鏡觀察數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件分析技技 術(shù)術(shù) 路路 線線生理鹽水組生理鹽水組統(tǒng)計(jì)學(xué)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Spss13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，血清學(xué)指標(biāo)比較采用單因素方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)期成果預(yù)期成

11、果 給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結(jié)給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠與給予糞菌水保留灌腸的潰腸炎大鼠與給予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠相比，血清瘍性結(jié)腸炎大鼠相比，血清DAO及及D-乳酸檢測(cè)值增大，說(shuō)明糞便菌群移植乳酸檢測(cè)值增大，說(shuō)明糞便菌群移植對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸黏膜屏障對(duì)于潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。具有保護(hù)作用。 給予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結(jié)腸炎給予糞菌水保留灌腸的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠與給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍大鼠與給予生理鹽水保留灌腸的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠相比，炎癥性腸病病理性結(jié)腸炎大鼠相比，炎癥性腸病病理下觀察損傷較輕。下觀察損傷較輕。 研究計(jì)劃研究計(jì)劃2014.

12、08-2015.03課題調(diào)研，文獻(xiàn)檢索，做好綜述2015.03-2015.7進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)；收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),完成實(shí)驗(yàn)2015.7-2016.03總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析撰寫并發(fā)表論文研究基礎(chǔ)研究基礎(chǔ)v 與本課題有關(guān)的，前期研究工作積累和已取得的研究工作成績(jī)已參閱大量與課題相關(guān)的中英文文獻(xiàn)及與本課題參考性較強(qiáng)的相關(guān)研究資料和理論。導(dǎo)師武華教授有深厚的學(xué)術(shù)造詣和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐能力，可為實(shí)驗(yàn)提供理論技術(shù)指導(dǎo)。已基本掌握動(dòng)物飼養(yǎng)、免疫組化等試驗(yàn)操作的基本要領(lǐng)。 研究基礎(chǔ)研究基礎(chǔ) 已具備的實(shí)驗(yàn)條件，尚缺少的實(shí)驗(yàn)條件和擬解決的途徑（包括利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和部門開放實(shí)驗(yàn)室的計(jì)劃與落實(shí)

13、情況） 山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室擁有進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的設(shè)備和技術(shù)力量，包括熒光及倒置顯微鏡、醫(yī)學(xué)圖象處理系統(tǒng)和低溫冰箱等主要儀器設(shè)備，同時(shí)可利用生理實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)科室的儀器設(shè)備。實(shí)驗(yàn)所需的相關(guān)的分子生物學(xué)試劑和免疫組化試劑均可從基因工程公司和試劑公司購(gòu)買。動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室有飼養(yǎng)動(dòng)物的動(dòng)物房和飼養(yǎng)條件。 分子免疫實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物中心的指導(dǎo)老師有豐富的理論實(shí)驗(yàn)技術(shù)和操作經(jīng)驗(yàn)，可為實(shí)驗(yàn)提供操作理論技術(shù)指導(dǎo)。經(jīng)費(fèi)預(yù)算經(jīng)費(fèi)預(yù)算支出科目金額|（萬(wàn)元）計(jì)算根據(jù)及理由合計(jì)0.70科研業(yè)務(wù)費(fèi)0.25文獻(xiàn)檢索費(fèi)、復(fù)印、學(xué)術(shù)交流、開題等實(shí)驗(yàn)材料費(fèi)0.40進(jìn)行動(dòng)物飼養(yǎng)，做好預(yù)實(shí)驗(yàn)；收集實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),完成實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備費(fèi)0

14、.50流式細(xì)胞儀等參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)1.Harrison OJ Maloy KJ. Innate immun eactivation inintestinal homeostasis. J Innate Immun，2011，3:585-593，Eri R，Simms LA，etal.Intestinal barrier dysfunction In inflammatory bowel diseases Inflamm Bowel Dis，2009，5:100-1133.Lewis K, Caldwell J, Phan V, Prescott D, Nazli A, Wang A, Sode

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