單味中藥協(xié)同誘導(dǎo)小鼠CIK 的初步討論

1、單味中藥協(xié)同誘導(dǎo)小鼠CIK 的初步討論細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞( cytokine induced killercell，CIK) 作為一種高效的腫瘤殺傷細(xì)胞，在腫瘤過繼免疫治療中顯示出良好效果，在人類CD+3CD+ 56的T 細(xì)胞是CIK 群體中主要效應(yīng)細(xì)胞。小鼠CIK 細(xì)胞，外表高表達(dá)NK1. 1 和CD8分子。國(guó)內(nèi)也有不少關(guān)于中藥協(xié)同DC 或CIK 殺傷腫瘤的報(bào)道，但目前人們對(duì)其研究大多集中在臨床應(yīng)用。筆者對(duì)于將小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)為CIK 進(jìn)展了研究，成功用純細(xì)胞因子誘導(dǎo)出了小鼠CIK 細(xì)胞，且明確了誘導(dǎo)方法。在此根底上，本研究以參加幾種中藥水煎劑同時(shí)細(xì)胞因子用量減少為原來的1 /2，討論

2、中藥協(xié)同誘導(dǎo)小鼠CIK 的可行性。1 材料與方法1. 1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57BL/6 小鼠，6 8 周，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)( 合格證號(hào): 11400700073629) ; 中藥材蟲草、石斛、黃精、仙茅、黃芪、人參、靈芝及半支蓮購(gòu)自北京同仁堂制藥; 重組小鼠IL - 1、IL - 2、 - IFN 購(gòu)自Peprotech 公司; 小鼠CD3單抗( 145 - 2C11) 、熒光標(biāo)記單抗NK1. 1 - PE、CD3e - APC、CD8 - FITC 和DX5 - FITC 購(gòu)eBioscience 公司; 小鼠淋巴細(xì)胞別離液( 達(dá)優(yōu)) 購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù); 1640 培

3、養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素購(gòu)自GIBCO 公司; CCK - 8殺傷試劑盒購(gòu)自東仁化學(xué)科技( 上海) 。1. 2 小鼠外周淋巴細(xì)胞制備C57BL /6 小鼠行眼球摘除放血后拉頸處死，無菌條件下取脾臟，別離脾細(xì)胞，參加到小鼠淋巴細(xì)胞別離液中，密度梯度離心法獲取小鼠淋巴細(xì)胞，無血清1640 培養(yǎng)基洗滌兩次，用1640 調(diào)整細(xì)胞濃度為1 106 /ml。1. 3 中藥藥液制備將1. 1 所列中藥材剪碎放入煎藥鍋中，參加適量超純水，中火力煎制，務(wù)使其保持微沸狀態(tài)煎20 min，棄藥渣，調(diào)節(jié)藥液體積達(dá)1 g 生藥對(duì)應(yīng)10 ml 藥液。分裝后凍存于- 20 冰箱。1. 4 確定最適用藥濃度如1. 2 所述制

4、備小鼠淋巴細(xì)胞，并鋪入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，放在37 、5%CO2孵箱中過夜孵育后，按濃度梯度( 濃度范圍200 0. 032 g /ml) 在各孔中參加中藥水劑，后經(jīng)CCK - 8 檢測(cè)，獲得每種藥劑最適使用濃度。1. 5 小鼠淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)1. 5. 1 純細(xì)胞因子誘導(dǎo)1. 2 方法制備的小鼠淋巴細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為含10% 胎牛血清和1 500U/ml - IFN 的1 640，于37 、5% CO2培養(yǎng)，24h 后再向每孔培養(yǎng)基中均參加抗CD3單抗( 50 ng /ml) 、IL - 1 ( 200 U/ml) 、IL - 2 ( 300 U/m1) 。以后每3 天更換含一樣濃度血清

5、和IL - 2 的培養(yǎng)基。1. 5. 2 單味中藥協(xié)同誘導(dǎo)將1. 5. 1 方法中所用細(xì)胞因子的量減少至原來量的1 /2，同時(shí)參加相應(yīng)最適濃度的中藥水煎劑，其他培養(yǎng)條件及方法與1. 5. 1 一樣，誘導(dǎo)效果由流式檢測(cè)作為評(píng)價(jià)方法。1. 6 誘導(dǎo)細(xì)胞的流式檢測(cè)取培養(yǎng)2 周的細(xì)胞進(jìn)展流式細(xì)胞檢測(cè)。將細(xì)胞用0. 2% BSA 的PBS ( 流式檢測(cè)Buffer) 洗滌兩遍，再用該Buffer 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 106 /ml。將4 種熒光標(biāo)記抗體雙染組合( NK1. 1 - PE + CD3e - APC、NK1. 1 - PE + CD8 -FITC、CD3e - APC + CD8 - F

6、ITC、NK1. 1 - PE +DX5 - FITC) 分別稀釋于50 l 冰冷的流式Buffer 中，再分別向各管抗體中參加50 l 細(xì)胞懸液，混勻，置4 避光反響30 min; 用冷Buffer 洗滌兩遍，每次1ml。最后用100 l 冷Buffer 重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)。陰性對(duì)照用未誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞。1. 7 誘導(dǎo)細(xì)胞殺瘤活性檢測(cè)根據(jù)流式檢測(cè)結(jié)果，將CIK 細(xì)胞特征性外表分子表達(dá)高的協(xié)同組分別與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 混合培養(yǎng)，效靶比分別為: 50 1、251、10 1。用CCK - 8 試劑檢測(cè)其對(duì)上述腫瘤細(xì)胞的殺瘤活性。殺傷活性計(jì)算公式為: 殺傷率% = 1 -( 實(shí)驗(yàn)

7、A 值- 空白孔A 值) /( 對(duì)照孔A 值- 空白孔A值) %。2 結(jié)果2. 1 通過梯度稀釋的中藥水煎劑作用于小鼠淋巴細(xì)胞，后用CCK - 8 檢測(cè)，得出各藥促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的最適濃度，用于接下來實(shí)驗(yàn)的使用濃度根據(jù)。2. 2 不同中藥水煎劑協(xié)同誘導(dǎo)的細(xì)胞經(jīng)流式檢測(cè)，與純細(xì)胞因子誘導(dǎo)的相比，其中蟲草、石斛、仙茅、黃芪4 種藥劑可以在所誘導(dǎo)細(xì)胞外表表達(dá)與之相近量或更多的CIK 特征性分子( NK1. 1 + CD+8、CD+3CD8+、NK1. 1 - DX5 - ) 。2. 3 蟲草、石斛、仙茅、黃芪協(xié)同誘導(dǎo)的細(xì)胞和小鼠SP2 /0細(xì)胞按不同效靶比混合培養(yǎng)后，用CCK - 8試劑檢測(cè)殺傷活性，結(jié)

8、果顯示石斛、仙茅和蟲草組在效靶比較高時(shí)殺傷活性亦高，效靶比較低時(shí)殺傷活性差，黃芪組在中等效靶比時(shí)顯示出殺傷效果，而高和低效靶比時(shí)無殺傷作用綜上結(jié)果可以得出: 蟲草、石斛、仙茅、黃芪4種中藥水煎劑協(xié)同細(xì)胞組合誘小鼠脾細(xì)胞，所得到的細(xì)胞外表NK1. 1、CD3、CD8高表達(dá)，與純細(xì)胞因子誘導(dǎo)得到的細(xì)胞相比，CD3、CD8雙陽(yáng)性率更高，且該4 種細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用明顯，符合CIK 細(xì)胞的特征。因此，這4 種中藥水煎劑可以協(xié)同細(xì)胞因子成功將小鼠脾淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)為CIK 細(xì)胞。3 討論很多中藥在臨床上有調(diào)節(jié)免疫的功能，實(shí)驗(yàn)也證明它們可直接作用于各類免疫細(xì)胞，如促進(jìn)其活化和增殖、增強(qiáng)其功能等。因此二者

9、結(jié)合，討論中藥是否可以在體外誘導(dǎo)和增強(qiáng)CIK 的作用是很有意義的。作為初步研究，本研究所選中藥是在臨床和實(shí)驗(yàn)中早已證明具有調(diào)節(jié)免疫及在抗腫瘤中常用到的單味藥，并且使用的是中藥的水煎劑。在這個(gè)根底上，可進(jìn)一步討論方劑及藥物單一成分對(duì)CIK 誘導(dǎo)和功能發(fā)揮的作用。本研究所選中藥中，有4 種中藥( 蟲草、石斛、仙茅、黃芪) 的水煎劑可以在減少細(xì)胞因子用量的情況下，有效誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞表達(dá)CIK 特征性外表分子。對(duì)其所誘導(dǎo)的CIK 進(jìn)展殺傷小鼠腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，結(jié)果說明與純細(xì)胞因子誘導(dǎo)的CIK 相比，石斛、仙茅和蟲草組在效靶比較高時(shí)殺傷活性高，其中石斛和蟲草組效果相對(duì)更好，仙茅效果較差。效靶比較低時(shí)中藥各組殺傷活性差，黃芪組在中等效靶比時(shí)顯示出殺傷效果，而高和低效靶比時(shí)無殺傷作用。這其中原因可能是: CIK 本質(zhì)上是一群異質(zhì)性細(xì)胞，不同中藥參與誘導(dǎo)的細(xì)胞群成分有所差異。另外，本研究所誘導(dǎo)的CIK ( 包括純因子誘導(dǎo)的) 與前期工作中用純因子誘導(dǎo)的CIK 在外表分子表達(dá)百分比上也有所不同( 本次CD+3CD+8占優(yōu)) ，可能原因?yàn)楸狙芯空T導(dǎo)中 -IFN 和IL - 1 用量高于前期研究。綜上所述，本研究初步