免疫熒光非特異性染色的消除方法

1、免疫熒光非特異性染色的消除方法一、非特異性染色的主要因素組織的非特異性染色的機(jī)理很復(fù)雜，其產(chǎn)生的原因主要可分為以下幾點(diǎn)：（1）一部分熒光素未與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結(jié)合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結(jié)合。（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應(yīng)抗體結(jié)合。（4）從組織中難于提純抗原性物質(zhì)，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。（5）抗體分子上標(biāo)記的熒光素分子太多，這種過(guò)量標(biāo)記的抗體分子帶過(guò)多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現(xiàn)非特異性染

2、色。（6）熒光素不純，標(biāo)本固定不當(dāng)?shù)?。二、消除非特異性染色的方法消除熒光抗體非特異性染色的方法應(yīng)根據(jù)產(chǎn)生的原因采取適當(dāng)?shù)姆椒?，常用的方法有以下幾種：（一）動(dòng)物臟器粉末吸收法常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動(dòng)2h，4中過(guò)夜，再攪拌10min，高速離心（300015000r/min）30min，12次后，即可使用其上清液。吸收一般應(yīng)在臨用前進(jìn)行，吸收后之熒光抗體保存冰箱中勿超過(guò)2周。染色應(yīng)作吸收前后之比較，吸收時(shí)可先用緩沖鹽水將組織干粉浸濕，離心（300015000r/min）30min，除去上清

3、液，再加入熒光抗體進(jìn)行吸收，以免消耗過(guò)多的抗體。肝粉或新鮮細(xì)胞吸收是一種非特異性的消除方法，對(duì)熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時(shí)，也可用相同的組織干粉或勻漿沉淀物吸收之。用臟器肝粉吸收對(duì)熒光抗體損失較多，如果根據(jù)Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗23次，12000r/min 10min離心沉淀，用其沉淀物吸收其熒光抗體即能完全達(dá)到目的，京極方久氏認(rèn)為這樣吸收對(duì)熒光抗體幾乎沒(méi)有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用時(shí)有必要再吸收一次?！靖畏鄣闹品ā浚?）將若干只小白鼠或大白鼠放血?dú)⑺溃〕龈闻K，用生理鹽水洗23次，除去

4、血液，剝掉表面的結(jié)締組織的脂肪。（2）剪碎，用生理鹽水反復(fù)洗滌至無(wú)血色止，然后再加生理鹽水少許，用組織搗碎機(jī)或勻漿器作成勻漿。（3）將肝勻漿裝入離心管內(nèi)（1/3左右），交換地用23倍量生理鹽水和丙酮反復(fù)洗滌各三次，至上清無(wú)血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉淀15min后，再除去上清液。（4）最后用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過(guò)濾，或離心沉淀，將沉淀物平鋪在潔凈的玻璃板上，37烤干（過(guò)夜）。（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過(guò)后，分裝，密封，低溫干燥保存。（二）透析法熒光素如FITC分子可以通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)大分子不能透過(guò)，可將未與蛋白結(jié)合的熒光素透析除去。（1）將標(biāo)記完畢的熒

5、光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內(nèi)，液面稍留空隙，緊扎。（2）浸入0.02mol/ph 7.17.4的PBS中（懸于大于標(biāo)記物體積約50100倍的PBS內(nèi)），在4中透析，每日更換34次PBS，約57天，透析液中無(wú)熒即可（在熒光光源照射下）。（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細(xì)方法參閱第二章。加入熒光抗體1518ml（按床體積的5%10%加樣），使其緩慢滲入柱內(nèi)，待即將全部入柱時(shí)，加入PBS少許，關(guān)閉下口，停留3040min ，使游離熒光充分進(jìn)入細(xì)篩孔中，然后再接通洗脫瓶開(kāi)始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量后，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留于上端的游離熒

6、光素之間拉開(kāi)明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來(lái)越大，熒光抗體最先流出，分前、中、后三部分收集，測(cè)F/P比值，合格者合并，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測(cè)定蛋白（發(fā)生沉淀反應(yīng)），繼續(xù)洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來(lái)，至洗脫液中無(wú)蛋白和熒光素后，此層析柱即可再用。若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過(guò)柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時(shí)即出現(xiàn)NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現(xiàn)蛋白時(shí)，即進(jìn)行收集，之后出現(xiàn)SO4+（用1%BaCl2檢查發(fā)生白色沉淀）。最后是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉淀），待洗脫液無(wú)SO4+及NH4+

7、后可再用。如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過(guò)濾23.5ml熒光抗體。（四）DEAE纖維素柱層析法標(biāo)記過(guò)多或過(guò)少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下：DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以干重每克交換2050mg標(biāo)記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標(biāo)記物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無(wú)色或淡綠色液體，洗脫液量（根據(jù)床體積大小每梯度乘3），然后依下列各種離子強(qiáng)度洗脫液，分別洗

8、脫和收集：0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/l NaCl）洗脫部分1。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/l NaCl）洗脫部分2。0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/l NaCl）洗脫部分3。將此三部分收集液（每管5ml）分別測(cè)定其F/P比值，0.05mol/l NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合并，濃縮保存?zhèn)溆?。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。（2）柱上吸附的過(guò)度標(biāo)記蛋白可繼續(xù)增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。經(jīng)過(guò)DEAE-纖維素層析后的標(biāo)記抗體，其抗體量一般約損失5

9、0%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細(xì)菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價(jià)測(cè)定的稀釋法除去非特異性染色。（五）熒光抗體稀釋法先測(cè)定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價(jià)，若二者效價(jià)相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽(yáng)性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價(jià)測(cè)定方法相同。（六）純化抗原法用各種方法提純單一成分的抗原是產(chǎn)生單價(jià)特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學(xué)技術(shù)（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關(guān)專著。（七）純化抗體法-免疫吸收法例如抗IgA血清的純化方法-免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反

10、應(yīng)，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：1人IgG聚合物的制備在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現(xiàn)混濁，逐現(xiàn)大塊膠塊，放置30min后，用研缽將凝膠磨細(xì)，繼用1.0mol/l pH7.0磷酸緩沖溶液反復(fù)洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。2免疫吸收法將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫?cái)嚢?0min,離心沉淀，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。（八）伊文氏藍(lán)（Evans blue）襯染法用0.01%伊文氏藍(lán)的0.01m