急性淋巴細胞白血病微量殘留病動態(tài)監(jiān)測的研究

1、    急性淋巴細胞白血病微量殘留病動態(tài)監(jiān)測的研究        【摘要】目的探討采用筑巢式聚合酶鏈反應（Nested-PCR）等多項指標監(jiān)測小兒急性淋巴細胞白血?。ˋLL）微量殘留?。∕RD）的臨床意義。方法98例ALL進行了形態(tài)學、免疫學和細胞遺傳學（MIC）分型，結合Nested-PCR、姐妹染色單體交換（SCE）、染色體核型分析，對58例ALL進行MRD監(jiān)測。結果：(1)58例ALL進行了T細胞受體（TCR）V2D3基因重排檢測，在41例B-ALL中34例（83%）及

2、4例T-ALL中1例具有此基因重排。檢測敏感度為10-510-6。(2)58例ALL中44例ALL進行了MRD-PCR動態(tài)監(jiān)測。結果顯示，維持強化治療期間PCR檢測由陰性轉為陽性或持續(xù)陽性者，易引起骨髓復發(fā)死亡，提示預后較差。PCR檢測轉陰時間有明顯的個體差異性，持續(xù)完全緩解（CCR） 3年以上的ALL患兒PCR持續(xù)轉陰可作為停用化療藥的可靠指標。(3)50例ALL進行了SCE的動態(tài)監(jiān)測，初發(fā)組SCE頻率高于CR組，差異有非常顯著意義?（P<0.001）。部分緩解組顯著高于CR組?（P<?0.01），SCE頻率變化與疾病的嚴重程度呈平行關系。(4)初發(fā)ALL中無論染色體核型正?；虍?/p>

3、常其SCE頻率均顯著增高，兩者無顯著性差異?（P>0.05），表明均有DNA嚴重損傷。結論在MIC分型診斷的基礎上，采用Nested-PCR、SCE、染色體核型分析等指標進行ALL的MRD動態(tài)監(jiān)測，綜合分析評價，對指導治療、預測復發(fā)、決定終止化療時間及判斷預后有臨床意義?！娟P鍵詞】白血病，淋巴細胞，急性腫瘤，殘余聚合酶鏈反應姐妹染色單體交換 The study of dynamic detection of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia GU Renkai, LU Jie, S

4、UN Lirong, et al. Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Medical College, Qingdao University, Qingdao 266003【Abstract】ObjectiveTo explore the clinical significance of detecting minimal residual disease (MRD) in children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) by using the methods of nest-p

5、olymerase chain reaction (Nest-PCR) and other detecting indexes. MethodsBased on the morphological, immunological and cytogenetic (MIC) classifications along with the detection of Nest-PCR, the frequency of the sister chromatid exchange (SCE) and the chromosome karyotype analysis, 98 children with A

6、LL were classified and 58 of 98 patients with ALL were detected for MRD. Results Fifty-eight patients with ALL were detected for gene rearrangements of T cell receptor (TCR) V2-D3. Thirty-four of 41 patients with B-ALL (82.9%) and 1 of 4 patients with T-ALL were found with the gene rearrangement. Th

7、e detecting senstivities of MRD were 10-510-6. Forty-four of 58 patients with ALL were detected dynamically for MRD. During intensive therapy, the patients with the positive PCR results converted from the negative and with the persistant positive PCR results preferred to relapse in bone marrow, whic

8、h would induce death and indicate a poor prognosis. The time of PCR results turned to negative was different individually. It might be an indicator of terminating chemotherapy that the MRD was undetectable in ALL patients with continued complete remission (CCR) for more than 3 years. The frequencies

9、 of SCE of bone marrow cells in 50 patients with ALL were detected dynamically. The frequencies of SCE in patients with primary ALL and patients with partial remission were higher than patients with complete remission (CR) (P0.001 and P0.01, respectively). The frequency of SCE was associated with th

10、e severity of the disease. In patients with primary ALL, the frequencies of SCE were increased both in the groups of normal and abnormal chromosome karyotype ?(P>0.05). ConclusionBased on the typing and diagnosis of MIC, the combination of PCR, SCE and chromosome karyotype analysis would play imp

11、ortant roles in guiding treatment, predicting bone marrow relapse, determining the time of terminating chemotherapy and evaluating prognosis.【Key words】Leukemia, lymphocytic, acuteNeoplasm, residualPolymerase chain reactionSister chromatid exchange國內外采用筑巢式聚合酶鏈反應（Nested-PCR）檢測白血病微量殘留?。∕RD），以其靈敏、特異而日益

12、受到重視。但目前多為一次性檢測或單項PCR指標動態(tài)監(jiān)測MRD。我們應用Nested-PCR、姐妹染色單體交換（SCE）、染色體核型分析、免疫分型及形態(tài)學分型相結合的方法，對98例小兒急性淋巴細胞白血病（ALL）進行分型診斷和MRD監(jiān)測的研究，以探討對指導臨床治療、預測骨髓復發(fā)、決定終止化療時間和判斷預后的臨床意義，現(xiàn)將結果報告如下。對象和方法一、對象1980年1月1997年12月在我院就診的98例ALL患兒（L1型21例、L2型75例、L3型2例）。男66例，女32例。年齡113歲，中位年齡6歲。二、免疫學分型標本取自骨髓，采用間接免疫熒光方法。陽性細胞30%為陽性標準。單克隆抗體（McAb）

13、中B系列有DR、CD19、CD10、CD20、;T系列有CD5、CD7、CD2、CD3、CD4、CD8、T9。三、染色體制備及分析染色體標本取自骨髓，ALL經2472小時培養(yǎng)后按常規(guī)法收集細胞，制片，經G顯帶。根據(jù)國際人類細胞遺傳學命名法進行染色體中期分裂相核型分析。四、SCE頻率分析經培養(yǎng)、制片、SCE分色和計數(shù)，鏡檢時每例分析2050個分散良好的中期分裂相，計數(shù)SCE頻率（每個中期相和每條染色體）。五、Nested-PCR檢測所用標本為ALL患兒的骨髓液或骨髓涂片，分別參照文獻1，2提取骨髓液或骨髓涂片中的DNA。采用Nested-PCR技術擴增T細胞受體（TCR）V2D3基因重排片斷3。

14、所用寡核苷酸引物由北京醫(yī)科大學提供，2對引物序列為：外側引物：5-TCA TCC ATC TCT CTC TCT TC-35-AAA TGC TAG CTA TTT CAC CCA-3內側引物：5-GCA CCA TCA GAG AGA GAT GA-35-TTG TAG CAC TGT GCG TAT CC-3每次實驗均設陽性、陰性對照。陽性對照來自診斷明確并具有TCRV2D3基因重排ALL患兒的骨髓DNA。陽性條帶清晰、光亮；如條帶彌漫或無特異性條帶形成則為陰性。六、統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）、中位數(shù)（M）和例數(shù)（n）表示；各組顯著性分析采用秩和檢驗。結

15、果一、免疫學分型85例ALL進行了免疫學分型檢查，其中81例為非T-ALL。按六型分類法4，B型4例，B型6例，B型41例，B型26例，B型3例，B型1例；4例T-ALL，按三型分類法5，T型3例，T型1例。二、染色體分析98例ALL進行了181例次的染色體檢查。82例ALL在確診時進行了染色體檢查，結果為正常核型40例，異常核型42例（51%），其中數(shù)目異常25例，結構異常1例，數(shù)目及結構均異常6例。41例ALL在疾病過程中進行了染色體動態(tài)觀察，共查染色體124例次。41例ALL分三組進行動態(tài)觀察：(1)非T-ALL初發(fā)時染色體核型正常組；(2)非T-ALL初發(fā)時染色體核型異常組；(3)T-

16、ALL組。結果顯示，初發(fā)時染色體核型正常的非T-ALL比核型異常的非T-ALL完全緩解(CR)率高，中位存活期長，死亡率低。非T-ALL伴有6q-核型的預后較好，伴有亞二倍體者預后較差，與文獻報道結果相一致6，7。三、SCE頻率分析50例ALL患兒接受SCE檢測，總檢126例次。根據(jù)不同的臨床轉歸將其分為三組：初發(fā)組、部分緩解（PR）組及CR組。同時檢測21例正常人作為對照組。各組SCE頻率結果見表1。表1ALL各組SCE頻率結果(±s)組別例數(shù)ALL SCE頻率每個中期相每條染色體(1組)對照組214.27±0.980.09±0.03(2組)初發(fā)組509.06&

17、#177;3.270.19±0.07(3組)PR組108.93±1.740.19±0.04(4組)CR組665.29±2.230.11±0.05注：表中4組比較，H=46.44，P0.001；組間兩兩比較：d12(第1、2組平均等級差)=69.71，P0.001；d13=75.32，P0.001；d14=19.36，P>0.05；d23=5.6，P0.05；d24=50.35，P<0.001；d34=55.96，P0.01 結果顯示：ALL初發(fā)時骨髓細胞SCE水平的損傷嚴重，即DNA損傷嚴重；CR時SCE頻率降低，DNA得到一定修復

18、，兩組間比較差異有非常顯著意義(d24=50.35，P<0.001)；PR組與CR組比較差異也有非常顯著意義(d34=55.96，P<0.01)；CR組SCE頻率仍高于對照組，但兩組間無顯著性差異?(d14=19.36，P >0.05)。以上結果表明DNA的損傷需要有一個逐漸修復的過程。50例初發(fā)ALL患兒中，正常核型與異常核型病例間的SCE頻率無顯著性差異（P>0.05）。表明初發(fā)病例無論是否有染色體畸變，其SCE頻率均顯著增高，反映了正常染色體核型病例亦有SCE水平的嚴重損傷8。四、Nested-PCR檢測1. Nested-PCR檢測結果：Nested-PCR擴增

19、TCRV2D3基因重排片斷，經電泳分析陽性產物為80 bp的DNA片斷。58例ALL進行了169例次TCRV2D3基因重排檢測。在41例B-ALL中，34例（83%）和4例T-ALL中1例檢出克隆特異性TCRV2D3基因重排。2. MRD動態(tài)檢測結果：58例ALL中44例ALL進行了155例次的MRD動態(tài)監(jiān)測，實驗敏感度達10-510-6，動態(tài)監(jiān)測結果見表2。表2?44例ALL患兒MRD的PCR動態(tài)檢測結果與生存關系PCR檢測結果例數(shù)生存時間(月)轉歸例數(shù)±sM范圍CR死亡陽性陰性9103±76111821690陽性弱陽性668±24703792601254

20、77;335612108111陽性陽性1441±29301099104陰性陰性388±88442818921合計4464±51528216386表2所示：(1)9例ALL于CR后PCR檢測由陽性轉為陰性，轉陰時間為6110個月，中位轉陰時間49個月。9例ALL中除3例仍在治療外，其余6例均已停藥觀察，至今已無病存活79-216個月，中位存活期126個月；(2)14例ALL的PCR檢測持續(xù)陽性，其中存活5年以下的11例ALL患兒，存活期?1054個月，中位存活期27個月，有4例骨髓復發(fā)死亡。存活5年以上的3例ALL患兒，存活期分別為76、91、99個月，PCR檢測雖

21、呈持續(xù)陽性反應，但仍處于CR狀態(tài)；(3)3例ALL初次TCRV2D3基因重排檢測及PCR動態(tài)監(jiān)測始終呈陰性反應，表明此3例ALL無TCRV2D3基因重排。 討論一、SCE頻率動態(tài)觀察的臨床意義SCE是體細胞有絲分裂中姐妹染色單體相同位置之間的物質交換，其形成與DNA損傷修復有密切關系。本研究對50例ALL進行了骨髓細胞SCE頻率的動態(tài)觀察分析，結果顯示，初發(fā)組、PR組的SCE頻率增高，與CR組比較差異有非常顯著意義（P0.001，P0.01）。表明ALL患兒治療前骨髓細胞SCE水平的損傷嚴重，反映了ALL可能存在著DNA損傷和修復機制的缺陷。CR組SCE頻率仍較對照組高，表明其DNA損傷未完全

22、修復，需有一個逐步恢復的過程。二、PCR檢測MRD的臨床意義MRD是導致白血病復發(fā)的根源，PCR檢測克隆特異性基因重排標志是最敏感而特異的方法，并認為絕大多數(shù)B系ALL有免疫球蛋白重鏈（IgH）和TCR基因重排。本研究采用TCRV2D3基因重排特異性標志對58例ALL進行MRD的PCR檢測，結果顯示41例中34例（83%）的B-ALL和4例中1例患兒的T-ALL中有TCRV2D3重排。TCRV2D3重排在B-ALL中發(fā)生率高，T-ALL發(fā)生率低，與文獻報道相一致9，10。經本組PCR動態(tài)檢測結果分析，認為：(1)持續(xù)完全緩解(CCR)3年以上的ALL患兒PCR檢測轉陰可作為停藥治療的可靠指標，

23、如6例PCR檢測轉陰患兒，停止化療后觀察至今，已無病存活79216個月，中位存活期125.5個月；(2)PCR轉陰時間有明顯的個體差異性。9例患兒PCR轉陰時間為6110個月，中位轉陰時間49個月。這可能與自身免疫功能清除白血病細胞的能力及化療強度有關。提示應采用個體化治療方案；(3)維持強化治療期間PCR由陰性轉為陽性或持續(xù)陽性者，易引起骨髓復發(fā)死亡，提示預后較差。認為此類患兒體內殘留的惡性細胞克隆具有較強的耐藥性和增殖活性，應加強化療強度或改用更有效的化療方案，使PCR盡快轉陰，以防止骨髓復發(fā)；(4)PCR陽性的長期無病存活患兒，轉歸有兩種可能性，一是存在復發(fā)的可能性;另一轉歸可能因殘留白

24、血病細胞本身或增殖微環(huán)境惡化而改變，使之失去增殖活性，多年后自然轉為陰性11。三、PCR、SCE、染色體分析三種指標動態(tài)監(jiān)測MRD的評價Nested-PCR檢測是一種高度敏感和特異的分析方法,MRD檢測可達10-510-6水平。CCR 3年以上的ALL患兒PCR持續(xù)轉陰可作為停藥治療的可靠指標。但PCR定性檢測不能精確的反映治療過程中MRD量的變化，最好進行MRD定量監(jiān)測。而SCE頻率變化與疾病的嚴重程度呈平行關系，對預測骨髓復發(fā)有一定的臨床價值。若Nested-PCR、SCE、染色體核型分析三者結合檢測，綜合分析評價，對指導臨床治療、預測復發(fā)、決定化療終止時間和判斷預后可能有更重要的臨床實用

25、價值。作者單位：266003 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒內科參考文獻1Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. 464-467.2Fey MF, Pilkingtin SP, Summers C, et al. Molecular diagnosis of haematological disorders using DNA from stored bone marrow sli

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