塞來昔布對人淋巴瘤細(xì)胞株Raji增殖、凋亡及存活素表達(dá)的影響

1、塞來昔布對人淋巴瘤細(xì)胞株Raji增殖、凋亡及存活素表達(dá)的影響         11-01-12 15:06:00     編輯：studa20                   作者：范紅 程遠(yuǎn)東 孫哲 呂曉東【摘要】  目的 觀察選擇性COX2抑制劑塞米昔布(Celecoxib)對Ra

2、ji細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，并檢測存活素(Survivin)在細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)分析Celecoxib對人Burkitt淋巴瘤Raji細(xì)胞周期的影響并檢測細(xì)胞凋亡及存活素在細(xì)胞中的表達(dá)情況，應(yīng)用RTPCR法檢測細(xì)胞中Survivin mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果 Celecoxib各濃度組作用于Raji細(xì)胞24、48、72 h后吸光度值與對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)各濃度組之間以及時(shí)間組之間有顯著性差異(P<0.05)。Celecoxib各濃度組作用于Raji細(xì)胞48 h后各濃度組間Celecoxib對細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影

3、響、下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)下調(diào)Survivin mRNA相對表達(dá)量具有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論 Celecoxib能夠通過誘導(dǎo)凋亡抑制Raji細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制Survivin表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  Celecoxib;淋巴瘤;細(xì)胞周期;凋亡;Survivin選擇性COX2抑制劑塞來昔布(Celecoxib)是近年來用于臨床的新型非甾體類抗炎藥，其藥理作用特點(diǎn)是選擇性作用于COX2，能使許多腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，但具體機(jī)制仍未完全清楚。Survivin作為一種多腫瘤抑制基因在腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中起調(diào)控作用。目前國內(nèi)外有關(guān)Survivin表達(dá)與Cele

4、coxib誘導(dǎo)淋巴瘤細(xì)胞凋亡之間關(guān)系的研究尚處于空白。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)人Burkitts淋巴瘤Raji細(xì)胞，觀察選擇性COX2抑制劑Celecoxib對Raji細(xì)胞生長增殖、凋亡及細(xì)胞周期分布的影響，并檢測凋亡抑制因子Survivin在細(xì)胞中的表達(dá)情況。1 材料與方法1.1 材料 Burkitts淋巴瘤細(xì)胞株Raji由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供，常規(guī)培養(yǎng)于含10%的滅活胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，23 d傳代1次。臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞拒染率均在95%以上。實(shí)驗(yàn)分為對照組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入與實(shí)驗(yàn)組等體積的DMSO。(預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示終濃度0

5、.1%的DMSO在實(shí)驗(yàn)中對Raji細(xì)胞生長沒有明顯影響);實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞培養(yǎng)基中加入DMSO溶解的Celecoxib(南京德寶生化器材有限公司)，終濃度分別為12.5、50、100、150 mol/L1。1.2 MTT法檢測Celecoxib對Raji細(xì)胞生長的抑制作用 取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/ml,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 l(1×104個(gè)細(xì)胞/孔)，分別加入處理因素，同時(shí)設(shè)對照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞孵育24、48、72 h,孵育結(jié)束前4 h，各培養(yǎng)孔加入MTT(Merke公司)(5 mg/ml)10 l,1 50

6、0 r/min離心10 min,棄上清，每孔加入DMSO 100 l。 震蕩15 min溶解結(jié)晶，全自動(dòng)酶標(biāo)儀測出每孔吸光度值(A492值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率。1.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率和周期分布 取對數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/ml,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 ml(1×106個(gè)細(xì)胞吼)，分別加入處理因素，同時(shí)設(shè)對照組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞孵育48 h后離心收集細(xì)胞，并用70%乙醇固定，4過夜后再經(jīng)PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)1 ml,4避光30 min，用Beckman Coulter公司提供的流式細(xì)胞儀標(biāo)

7、準(zhǔn)程序進(jìn)行分析。1.4 FCM檢測Raji細(xì)胞中Survivin蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，去除樣品中的70%乙醇，用PBS離心洗滌2次，加入Survivin鼠抗人單克隆抗體一抗(Santa公司)工作液100 l,工作濃度1100(克隆系FL142)。室溫孵育30 min，PBS10 ml洗滌1次，棄上清。加入羊抗鼠FITCIgG二抗工作液100 l,室溫孵育30 min，PBS 10 ml離心同上，棄上清，加入PBS 0.1 ml經(jīng)500目銅網(wǎng)過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。1.5 RTPCR法檢測Raji細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)水平1.5.1 細(xì)胞總RNA提取:Trizol試劑盒提取RNA。1.5.

8、2 RTPCR (1)引物設(shè)計(jì):Survivin、actin引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Survivin:上游引物5GCATGGGTGCCCCGACGTG3，下游引物5GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA3，擴(kuò)增片段長度為447 bp;actin:上游引物5GGCGGCACCACCATGTACCC3，下游引物5AGGGGCCGGACTCGTCATAC3，擴(kuò)增片段長度為202 bp。 (2)總反應(yīng)體積30 l:含無菌雙蒸水19.3 l，MgCl22 l,20× buffer 1.5 l，上游、下游引物各1 l,RNA模板2 l,dNTP 1.2 l,RTPCR酶混合

9、物2 l。預(yù)變性94，2 min;變性94，1 min。退火55，50 s。延伸72，50 s，共35個(gè)循環(huán)，72再延伸10 min，凝膠成像，GelPro Analyzer 3.1軟件進(jìn)行半定量分析。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用x±s表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析。2 結(jié) 果2.1 Celecoxib對Raji細(xì)胞生長的抑制作用 Celecoxib各濃度組作用于Raji細(xì)胞24、48、72 h后，對細(xì)胞生長均有抑制作用，吸光度與相應(yīng)對照組相比均有顯著性差異(P<0.05)，各濃度組之間以及時(shí)間組之間有顯著性差異(P<

10、0.05)，說明不同濃度Celecoxib均有抑制Raji細(xì)胞增殖作用，此作用呈時(shí)間、劑量依賴性。Celecoxib各濃度組作用Raji細(xì)胞48 h后出現(xiàn)明顯的凋亡峰，各濃度組間Celecoxib對細(xì)胞凋亡率的影響差異明顯(P<0.05),說明隨著Celecoxib濃度增加，可引起Raji細(xì)胞凋亡率逐漸增大，即凋亡的細(xì)胞數(shù)量與Celecoxib呈量效關(guān)系，見表1。表1 Celecoxib對Raji細(xì)胞生長的抑制作用2.2 Celecoxib對Raji細(xì)胞周期分布的影響 各濃度組Celecoxib作用Raji細(xì)胞48 h后，隨藥物濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期及G2/M期細(xì)胞

11、比例逐漸減少。Celecoxib可阻滯Raji細(xì)胞于GO/G1期，且隨著Celecoxib濃度的增加，阻滯作用增強(qiáng)，呈一定劑量依賴關(guān)系(P<0.05)，見表2。表2 Celecoxib對Raji細(xì)胞周期分布的影響2.3 Celecoxib對Raji細(xì)胞Survivin蛋白和Survivin mRNA表達(dá)水平的影響 Celecoxib各濃度組作用Raji細(xì)胞48 h后，隨著Celecoxib濃度的增加，Raji細(xì)胞中Survivin蛋白的表達(dá)率逐漸減低，呈一定劑量依賴關(guān)系。Celecoxib不同濃度組間下調(diào)Survivin蛋白表達(dá)也具有顯著意義(P<0.05)(表3)。Raji細(xì)胞中Survivin mRNA 的相對表達(dá)量逐漸減低，呈一定劑量依賴關(guān)系。Celecoxib不同濃度組間下調(diào)Survivin mRNA表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。1：Celecoxib 150 mol/L，2：Celecoxib 100