無菌檢法試驗(yàn)具體操作方法PPT課件

1、logo實(shí)際應(yīng)用及注意事項(xiàng)實(shí)際應(yīng)用及注意事項(xiàng)company logo分類分類 具體檢測方法具體檢測方法 討論討論概述概述試驗(yàn)物品準(zhǔn)備試驗(yàn)物品準(zhǔn)備無菌操作的要求及注意事項(xiàng)無菌操作的要求及注意事項(xiàng)company logo一、概述v無菌檢查法系用于確定要求無菌的生物制品、原料、輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種辦法。v若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。v無菌檢查在生產(chǎn)檢定中是很重要的一個(gè)檢項(xiàng)，如果出現(xiàn)差錯(cuò)會(huì)有很大的隱患，近年注冊申報(bào)資料中無菌檢查法驗(yàn)證的內(nèi)容確實(shí)在日漸完整和規(guī)范。v2005年版中國藥典無菌檢查法增加了方法驗(yàn)證的內(nèi)容，增加了試驗(yàn)的可操作性，方

2、法更具有科學(xué)性，提高檢出率。保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。company logo二、試驗(yàn)物品準(zhǔn)備v1、培養(yǎng)基數(shù)量及選用： 首先要確認(rèn)本次試驗(yàn)供試品所需培養(yǎng)基的數(shù)量。 在此基礎(chǔ)，要多加一套相同的培養(yǎng)基做陰性對(duì)照。v 合格的培養(yǎng)基應(yīng)保存在2-25并防止被污染,v 使用期限不得超過3周. 無菌試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基的質(zhì)量要求高，應(yīng)選用完全透明無沉淀的培養(yǎng)基，確認(rèn)檢查合格后放入試管架中，置操作間，方可使用。company logo二、試驗(yàn)物品準(zhǔn)備v在選取培養(yǎng)基時(shí)，放于眼前細(xì)致觀察（包括ph值，裝量是否一致、試管有無裂痕）v因培養(yǎng)基在搬運(yùn)過程中，容易造成個(gè)別試管膠栓松動(dòng)，從而影響ph值的細(xì)微變化。v如不細(xì)致察看，在試驗(yàn)

3、中會(huì)存有很大的隱患，影響結(jié)果的判定。company logo二、試驗(yàn)物品準(zhǔn)備：v2、滅菌物品的確認(rèn)： 高壓根據(jù)試驗(yàn)要求，準(zhǔn)備所需器材和物品。需在滅菌物品盒標(biāo)注名稱，并填寫滅菌日期，清點(diǎn)無誤后將其送至滅菌前間。 滅菌是無菌物品生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)，根據(jù)物品的性能選擇合適的滅菌方式，是確保試驗(yàn)質(zhì)量的關(guān)鍵。 我們通常把玻璃器皿包括吸管瓶子選擇1802小時(shí)干熱滅菌，膠栓12160分鐘滅菌，取回滅菌物品時(shí)，一定要在有效期內(nèi)使用，試驗(yàn)前確認(rèn)指示劑是否合格及包裝的完整性，干燥性，合格后方可使用。company logo二、試驗(yàn)物品準(zhǔn)備：v物品擺放整齊的準(zhǔn)備間：company logo二、試驗(yàn)物品準(zhǔn)備：v工作人員在

4、控制高壓溫度：company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)環(huán)境環(huán)境操作操作人員人員company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)：1.無菌操作應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)和局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。2.工作臺(tái)面及操作室環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng) 3.無菌操作室每天都要用0.1%的新潔爾滅或來蘇水清潔劑，清潔次(抹布要專用).紫外線照射消毒30-50min； 超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75酒精擦洗。然后紫外

5、線消毒30min。在工作臺(tái)面消毒時(shí)切勿將供試品和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線，消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋紫外線，降低消毒效果。company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)： 無菌試驗(yàn)操作進(jìn)入萬級(jí)操作間時(shí)，操作人員必須著裝整齊，穿好已滅菌的三更服裝。 需帶兩層口罩，一層是白紗布，最后一層隨三更服已滅菌的口罩。 方可進(jìn)入無菌室進(jìn)行操作 。company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng). . company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng) 在操作中為最大可能的保證無菌。在操作中為最大可能的保證無菌。在操作中為最大可能的保證無菌。 每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊。每一項(xiàng)工

6、作都必須做到有條不紊。每一項(xiàng)工作都必須做到有條不紊。company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)1.在開試驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序。 有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。 準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點(diǎn)無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺(tái))內(nèi)，然后開始消毒。 這可以避免開始實(shí)驗(yàn)后，因物品不全，往返拿取而增加污染機(jī)會(huì)。 company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng) 2.在無菌環(huán)境進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，操作人員要確定好自己所工作的位置，操作前戴手套，酒精棉進(jìn)行消毒。 3.點(diǎn)燃煤氣燈后。用火焰先把試管架上的培養(yǎng)基膠栓與試管口處燒灼一下，以后一切操作，如打開或封閉瓶口時(shí)，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進(jìn)行。

7、但要注意：金屬器械不能在火焰中燒的時(shí)間過長，燒過的金屬鑷要待冷卻后方可使用。 company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)4.吸取過營養(yǎng)液后的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入培養(yǎng)基中。 開啟、關(guān)閉供試品時(shí)，火焰滅菌時(shí)間要短，防止因溫度過高滅活供試品。 另外膠塞過火焰時(shí)也不能時(shí)間長，以免燒焦產(chǎn)生有毒氣體，危害供試品。5.進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，吸管抽取供試品后，要與培養(yǎng)基試管平行且垂直，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。company logo三、無菌操作要求及注意事項(xiàng)6.吸取營養(yǎng)液、 氯化鈉等及各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能

8、混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е陆徊嫖廴?。手或拿取物品時(shí)不能經(jīng)過打開的瓶口上方，加液時(shí)如吸管尖碰到瓶口，則應(yīng)將吸管廢棄。7.不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。工作由始至終要保持一定順序性。供試品在未使用之前，用煤氣燈先把試管架上的培養(yǎng)基膠栓及試管口處燒灼一下，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養(yǎng)基在未用前，不要過早開栓 用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口，直立可增加落菌機(jī)會(huì)。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法 company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 無菌試驗(yàn)樣品取樣標(biāo)準(zhǔn)：v 1

9、.原液及半成品： 抽檢量應(yīng)至少為0.1%，但不得少于10ml，如原液及半成品除菌過濾后，分別于多個(gè)容器內(nèi)，則每個(gè)容器抽檢量不得少于10ml，原液及半成品每開瓶一次，應(yīng)如上法抽檢。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 無菌試驗(yàn)樣品取樣標(biāo)準(zhǔn)：v 2.成品： 每亞批均應(yīng)進(jìn)行無菌檢查，供試品應(yīng)隨時(shí)抽取，包括分裝過程中的前、中、后抽樣。 分裝量在100支（瓶）或100支（瓶）以下者抽驗(yàn)量不少于5支。 101-500支（瓶）者抽驗(yàn)量不少于10支（瓶）。 500支（瓶）以上者抽驗(yàn)量不少于20支（瓶）。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法123無菌試驗(yàn)檢測方法無菌試驗(yàn)

10、檢測方法 company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v增菌法： 含防腐劑的供試品，應(yīng)先增菌培養(yǎng).v按種量與培養(yǎng)基的比例： 用苯酚或三氯甲烷作防腐劑者至少為1:20， 用汞作防腐劑者或制品內(nèi)含有甲醛，抗生素者至少為1:50.v將混合供試品先按此比例接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（不得少于200ml）內(nèi)增菌，于20-25培養(yǎng)3天后移種至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂斜面，改良馬丁培養(yǎng)基各2管，每管10ml，培養(yǎng)基接種0.5ml。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v直接法: 不含防腐劑供試品，不需增菌培養(yǎng).v按成品抽樣量及抽驗(yàn)瓶數(shù)的要求將每批（或亞批）抽檢的供試品逐瓶

11、（支）取樣混合: 裝量在5.0ml或5.0ml以下者每10瓶（安裝）混合，裝量在5.0ml以上者，每7瓶（安裝）混合，v應(yīng)接種培養(yǎng)基管數(shù)依供試品混合總量而定。v混合后的供試品接種量按不超過培養(yǎng)基體積10%（ml/ml）直接接種于硫乙醇鹽酸流體培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂斜面及改良馬丁培養(yǎng)基，三種培養(yǎng)基接種支數(shù)之比為1：1：1。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 薄膜過濾法:v 采用全封閉式薄膜過濾器，薄膜孔徑不大于0.45um，膜直徑約47mm.v 取規(guī)定抽驗(yàn)供試品數(shù)，（如供試品少于10ml，則先加入100ml0.9%,無菌氯化鈉溶液或適宜的無菌溶劑），立即在無菌條件下導(dǎo)入無菌薄膜

12、過濾器內(nèi)，加壓或減壓過濾。v 含汞類等防腐劑的供試品，在供試品過濾后，用0.9%無菌氯化鈉溶液或其他適宜的無菌溶劑沖洗濾膜3次，每次100ml，過濾后，兩個(gè)濾器中加硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基各100ml，另一個(gè)濾器加改良馬丁培養(yǎng)基100ml。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法company logo四、具體檢測方法無菌試驗(yàn)結(jié)果判定： 對(duì)每一試管逐一進(jìn)行驗(yàn)證，ph是否有變化有無菌落生長，應(yīng)完全透明無沉淀。v 1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基均為澄清，營養(yǎng)瓊脂斜面未見菌生長，判供式品符合規(guī)定。v 2.如硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面中任何一管有菌生長，并證

13、明生長的微生物為供試品含有，判定供式品不符合規(guī)定。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法當(dāng)滿足下列至少一個(gè)條件時(shí)，判實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效： v 對(duì)無菌檢查相關(guān)設(shè)施的微生物監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)表明其不符合其規(guī)定；v 對(duì)無菌檢查過程的回顧，揭示了本操作程序是錯(cuò)誤的；v 陰性對(duì)照管有菌生長；v 供試品管中生長的微生物經(jīng)鑒定后，確證微生物生長是因無菌檢查中使用的物品和無菌操作技術(shù)不當(dāng)引起的；company logo四、具體檢測方法供試品復(fù)檢v 無菌無菌試驗(yàn)如經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重試。 重試時(shí)，重新取同量供試品，依法重試， 如無菌生長，判供試品符合規(guī)定 ， 如有菌生長，判供試品不符合規(guī)定。company log

14、o四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 支原體：支原體：company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 細(xì)胞培養(yǎng)（特別是傳代細(xì)胞）被支原體污染是個(gè)世界性問題。v 在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，國內(nèi)外研究表明，大約有二十多種支原體能污染細(xì)胞，有的細(xì)胞株可以同時(shí)污染兩種以上的支原體。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法口腔支原體 精氨酸支原體豬鼻支原體萊氏無膽甾原體為牛源性company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 支原體檢測支原體檢測：v 支原體因病毒類疫苗類中所用的牛血清可能被感染支原體，所以生產(chǎn)所收獲病毒收獲液都要做支原體檢測。 v 使

15、用培養(yǎng)基為流體和半流體培養(yǎng)基。company logo四、具體檢測方法工作環(huán)境的污染工作環(huán)境的污染被污染細(xì)胞造成被污染細(xì)胞造成的交叉污染的交叉污染操作者本身的污染操作者本身的污染某些支原體在人體某些支原體在人體是正常菌群是正常菌群制備細(xì)胞的原始組織制備細(xì)胞的原始組織或器官的污染或器官的污染培養(yǎng)基的污染培養(yǎng)基的污染實(shí)驗(yàn)器材的污實(shí)驗(yàn)器材的污染染支原體支原體污染源污染源company logo四、四、具體檢測方法v 圖為圖為ghkghk細(xì)胞細(xì)胞當(dāng)支原體污染后，因?yàn)樗鼈儾粫?huì)使細(xì)胞死亡可以與細(xì)胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細(xì)胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺。實(shí)則細(xì)胞受到多方面潛在影響，如引起細(xì)胞變

16、形，抑制細(xì)胞生長等。最為致命的是，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染，細(xì)胞外觀可無明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染，而貌似正常的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)，將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 支原體檢測步驟：v 供試品如在分裝后，24小時(shí)以內(nèi)進(jìn)行支原體檢查可儲(chǔ)存于2-8，超過24小時(shí)應(yīng)置-20以下儲(chǔ)存。v 支原體半流體培養(yǎng)基使用前煮沸10-15分鐘，冷卻至56左右備用。v 支原體半流體培養(yǎng)基與支原體肉湯培養(yǎng)基加入滅能小牛血清（培養(yǎng)基：血清為8：2）company logo四、具體檢測方法支原體半流體培養(yǎng)基（4支）支原體肉湯培養(yǎng)基（4支）第7天，取2支第7天，取2支

17、一支一支一支一支半流體2支肉湯2支半流體2支肉湯2支半流體2支半流體2支肉湯2支肉湯2支移種前剩余培養(yǎng)基及移種后的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)21天，（361）。每隔3天觀察一次company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 一旦支原體污染：一旦支原體污染：一律廢棄重新培養(yǎng)。一律廢棄重新培養(yǎng)。對(duì)于具有重要價(jià)值的細(xì)胞株， 有必要清除支原體的，常用方法有：抗生素處理抗血清處理：抗生素加抗血清和補(bǔ)體聯(lián)合處理company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法v 支原體最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒有細(xì)胞壁，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素：如 -內(nèi)酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對(duì)多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對(duì)支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對(duì)支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學(xué)治療劑。 company logo四、具體檢測方法四、具體檢測方法company logo五、討論 污染是細(xì)胞培養(yǎng)中面臨的主要問題。 某些污染的發(fā)生（特別是支原體和少部分的真菌）往往難以察覺檢測。而且污染源能長期共存于培養(yǎng)體系中，在實(shí)驗(yàn)前期