霍奇金淋巴瘤實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)ppt課件

1、霍奇金淋巴瘤中IB基因突變的研討 研討背景霍奇金淋巴瘤霍奇金淋巴瘤Hodgkins lymphoma，HL，Hodgkins disease，是惡性淋巴瘤的一個獨(dú)特是惡性淋巴瘤的一個獨(dú)特類型。類型。 研討背景 其特點(diǎn)為：臨床上病變往往從一個或一組淋巴結(jié)開場，逐漸由臨近的淋巴結(jié)向遠(yuǎn)處分散。原發(fā)于結(jié)外淋巴組織的少見。研討背景 瘤組織成分多樣，但HL特異性的病理改動為大量反響性增生的背景淋巴細(xì)胞中可見少于1%Reed-Sternberg細(xì)胞R-S細(xì)胞。 這種特殊的瘤巨細(xì)胞來源于B淋巴細(xì)胞 (鏡影細(xì)胞)研討背景 p53和bcl-2基因突變 EB病毒感染 但證據(jù)均缺乏，HL的發(fā)病機(jī)制 尚未明確研討背景

2、有研討發(fā)現(xiàn)NF-B (RelA/P50)的組成性激活是霍奇金淋巴瘤細(xì)胞的特點(diǎn)。1 IB作為重要的NF-B通路抑制因子，在多種瘤細(xì)胞中表達(dá)量均減少。研討背景 將對IB激酶 IB kinase, IKK無反響的IB突變體導(dǎo)入HRS細(xì)胞中可阻斷NF-B的活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，闡明IB在HL發(fā)病機(jī)制中有重要作用。2研討背景 Emmerich等人的研討闡明HRS細(xì)胞中IB mRNA高表達(dá)，但在蛋白程度檢測的陽性強(qiáng)度弱，能夠與HL中泛素化降解活性加強(qiáng)有關(guān)，也能夠由IB蛋白構(gòu)造改動導(dǎo)致。3研討目的 本實(shí)驗(yàn)意在： 了解IB基因在HL中突變的情況； 分析經(jīng)典型HL HRS中IB突變的特點(diǎn)、能夠呵斥的蛋白構(gòu)造異常；

3、 以及這些異常的病理意義，即其與HL發(fā)病的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)資料與試劑 霍奇金淋巴瘤組織樣本 CD30單抗Dako公司，克隆號BerH2，效價1：20 Leica ASLMD激光顯微系統(tǒng) PCR引物北京賽百勝公司 PCR儀包括反響體系 DNA測序儀實(shí)驗(yàn)流程CD30免疫組化激光顯微切割和DNA 提取IB基因擴(kuò)增PCR產(chǎn)物檢測待測基因外含子測序CD30免疫組化 采用EnVision兩步法。 將冰凍組織切成6m厚延續(xù)切片，貼于Leica PEN膜空白切片上，用含005 NP40的丙酮(vv)固定10 min，室溫下自然枯燥；CD30免疫組化 6 H2O2-甲醇，37 10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；

4、加1：20稀釋的一抗； 加相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，充分水洗。激光顯微切割和DNA 提取 用Leica ASLMD系統(tǒng)逐個切割組織切片上的CD30陽性細(xì)胞切割參數(shù)：激光強(qiáng)度37，波長377，速度5，光束直徑8。 將目的細(xì)胞從切片上分別，在光壓強(qiáng)作用下被搜集到離心管蓋內(nèi)，每例標(biāo)本36組，每組約2570個細(xì)胞。 切割周圍的正常淋巴細(xì)胞每例2管， 每管約50個細(xì)胞。 擴(kuò)增目的基因，上游引物： 5-CACACTGTGCCCATCTACG-3，下游引物：5一GGTc1-ITIGCGGATGTCCAC一3。 緩沖體系：10X反響緩沖液25 l，MgCL2(25 mmolL)15 l

5、，dNTP(10 mmoLL)10 l，上游引物(10 moL L)05 l，下游引物(10 molL)05 l，Taq酶(5 U L)03 l， 模板20 l，總體積25 l。反響條件：94預(yù)變性5 min，94變性1 min，55退火1 min，72oC延伸1 min，共40個循環(huán)，72延伸7min，至4終了。 以雙蒸水替代DNA模板作為陰性對照。IB基因擴(kuò)增 對HRS細(xì)胞、背景中反響性增生細(xì)胞的IB 6個外顯子進(jìn)展半巢式PCR擴(kuò)增。 用知IB外顯子PCR擴(kuò)增陽性的標(biāo)本為模板作陽性對照，用雙蒸水作為陰性對照。PCR擴(kuò)增反響體系擴(kuò)增擴(kuò)增IB第一和第二外顯子反響體系：第一和第二外顯子反響體系：

6、 10 X PCR緩沖液緩沖液50 1，MgC1：(25mmoiL)50 Ixl，dNTPs(10 mmol L)20 l，DMSO20 l，Taq DNA聚合酶聚合酶(5 UpJ)10 l，DNA模板模板(05 gIL1)20 l，擴(kuò)增第一外顯子時加引物，擴(kuò)增第一外顯子時加引物1 Ixl；擴(kuò)增第；擴(kuò)增第二外顯子時加引物二外顯子時加引物03 l，補(bǔ)所需，補(bǔ)所需ddH2O使反響體系到達(dá)使反響體系到達(dá)50 I。反響條件：。反響條件：預(yù)變性預(yù)變性95 ，5min，繼而，繼而95變性變性50 s，65退火退火30 s，72延伸延伸90 S，共共35個循環(huán)，最后個循環(huán)，最后72延伸延伸10 min。第二

7、輪，反響體系。第二輪，反響體系50 l，擴(kuò)增第一和，擴(kuò)增第一和第二外顯子時加引物第二外顯子時加引物125 l。擴(kuò)增第一外顯子時另加。擴(kuò)增第一外顯子時另加2 l DMSO(擴(kuò)增第擴(kuò)增第二外顯子時不加二外顯子時不加DMSO)。反響條件同第一輪。反響條件同第一輪。擴(kuò)增擴(kuò)增IB第三到第六外顯子反響體系：第三到第六外顯子反響體系： 第一輪，第一輪，l0PCR緩沖液緩沖液50 Ixl，MgCL2(25 mmolL)40 l，dNTPs(10 mmolL)20 l，Taq DNA聚合酶聚合酶(5 U L)10 l，DNA模模板板(05 g L)20 l，引物，引物1 l。反響條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，。反響

8、條件同擴(kuò)增一、二外顯子者，但退火溫度為但退火溫度為63。第二輪，反響體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為。第二輪，反響體系同第一輪，但擴(kuò)增引物為125 L。反響條件為預(yù)變性反響條件為預(yù)變性95 ，5 min，繼而，繼而95變性變性50 S，65退火退火30 S，72 oC延伸延伸90 S，共，共35個循環(huán)，最后個循環(huán)，最后72延伸延伸10 min。PCR產(chǎn)物檢測 取5 l PCR產(chǎn)物，用2瓊脂糖凝膠電泳分析，穩(wěn)流120 mA，20 min。 紫外燈下察看。 IB的6個外顯子陽性擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為exon1(476bp)、 exon2(433bp)、 exon3(399bp)、 exon4(184bp)、

9、 exon5(381bp)和 exon6(441bp)。預(yù)期結(jié)果電泳電泳條帶不在同一程度線上基因明顯突變。預(yù)期結(jié)果電泳電泳條帶在同一程度線上。沒有突變點(diǎn)突變或分子量很小的堿基序列突變待測基因外含子測序 每管DNA樣品都要擴(kuò)增2次，運(yùn)用上海博亞公司ABI377DNA測序儀對PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)展直接測序。預(yù)期結(jié)果測序堿基序列出現(xiàn)改動圖A-箭頭處為T-A突變TGA為終止密碼圖B-反向測序證明藍(lán)色-C,紅色-T，綠色-A，黑色-G預(yù)期結(jié)果堿基序列沒有突變 C、D分別為沒有突變的正、反向測序預(yù)期結(jié)果 腫瘤細(xì)胞IB基因突變率高，而反響性增生的淋巴細(xì)胞IB基因沒有突變。 腫瘤細(xì)胞和反響性增生的淋巴細(xì)胞的IB基

10、因都沒有突變。 腫瘤細(xì)胞和反響性增生的淋巴細(xì)胞的IB的突變率都添加IB基因參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化有關(guān)IB基因沒有參與霍奇金淋巴瘤的發(fā)生和惡化估計(jì)不會發(fā)生這種情況，如假設(shè)發(fā)生那么需求進(jìn)一步研討參考文獻(xiàn)1 Bargou R.C, et al. Constitutive nuclear factor-kappaB-RelA activation is required for proliferation and survival of Hodgkins disease tumor cells J. J Clin Invest, 2019, 100 (12): 2961-9.2 Dejardin

11、 E, et al. Regulation of NF-kappaB activity by IkappaB-related proteins in adenocarcinoma cells J. Oncogene, 2019, 18(16):2567-77.3 Emmerich F, et al. Overexpression of I kappa B alpha without inhibition of NF-kappaB activity and mutations in the I kappaB alpha gene in Reed-Sternberg cells J. Blood,

12、 2019, 94(9): 3129-34. Thank you！巢式PCR 巢式聚合酶鏈反響巢式聚合酶鏈反響(nested polymearse chain reaction, nPCR)也稱套式也稱套式PCR。 在這種技術(shù)中，首先用一對外引物進(jìn)展第在這種技術(shù)中，首先用一對外引物進(jìn)展第1輪輪PCR，然后再運(yùn)用第，然后再運(yùn)用第1對引物擴(kuò)增的對引物擴(kuò)增的DNA序列內(nèi)部的一對引物再次擴(kuò)增，所以稱為序列內(nèi)部的一對引物再次擴(kuò)增，所以稱為巢式巢式PCR。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第。為了經(jīng)濟(jì)節(jié)約，可在第2輪擴(kuò)增輪擴(kuò)增時采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引時采用半巢式，設(shè)計(jì)單條引物，另一條引物與第物與第1輪擴(kuò)增共用，。輪擴(kuò)增共用，。 反向測序 一個是正向引物上游引物，用它來測序就是正向測序(從上游往下測序)，也就是5到3 另外一個就是反向引物下游引物，用它來測序就是反向測序從下游往上測序，也就是3到5 假設(shè)片段在800以內(nèi)，那么隨意進(jìn)展一個方向就能測出他