甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用

1、甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用基金項目：國家自然科學基金項目（30400352）；教育部重點項目（205045）；黑龍江省自然科學基金（D200611）；黑龍江省研究生創(chuàng)新基金（YJSCX2006-0077HSD）作者簡介：季宇彬(1956-)，男，教授，博士生導師，研究方向為腫瘤藥理學的研究。季宇彬1,2，馮小燕1,2，高世勇1,2（1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱150076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076）摘要：研究甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用。應用MTT法觀察體外甜菜堿在不同濃度、不同時間對小鼠脾淋巴細胞

2、增殖的影響，應用流式細胞儀（FCM）測小鼠脾淋巴細胞在不同時間周期的變化。結(jié)果表明：甜菜堿終濃度0.4mM、4mM、20mM均可促淋巴細胞增值，但終濃度4mM效果最為明顯，在甜菜堿刺激24h、48h、72h后，淋巴細胞均可顯著增值，但隨時間的加倍，增值幅度并不明顯，綜合考慮，24h效果更好。終濃度4mM甜菜堿不同時間均可促進淋巴細胞由G0/G1期進入S期，且作用18h效果最明顯，其G0/G1期由97.03%下降到89.99%，S期由2.58%升高到9.08%。到24h后，其誘導作用反而有些下降。因此，甜菜堿4mM作用24h促淋巴細胞增殖最為理想。4mM的甜菜堿18h促進淋巴細胞由G0/G1期進

3、入S期的作用效果最好。關鍵詞：甜菜堿；淋巴細胞增殖；細胞周期 Effects of Betaine on Mouse Splen-lymphocytes in VitroJI yu-bin1,2, FENG xiao-yan1,2, GAO shi-yong1,2(1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin University of Commerce. Harbin 150076, China. 2. Engineering Research Center

4、of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education. Harbin 150076, China)Abstract: To investigate the effects of Betaine on splen-lymphocytes proliferation, To observe the effects of the Betaine on the lymphocyte proliferation of mouse by MTT at different concentrations and times. To observe the eff

5、ects of the Betaine on the lymphocyte proliferation cell-cycle of mouse by FCM. The result indicate that Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the concentrations of 0.4mM、4mM and 20mM, but 4mM is the best; Betaine can stimulate lymphocytes proliferation at the time of 24h、48h and 72h, b

6、ut 24h is the best. Betaine can change the cell-cycle distribution of lymphocytes at different times, and the best time of increasing the proportion of S-phase cells is 18h , raising from 2.58% to 9.08%. So, betaine can stimulate lymphocytes proliferation and the best concentrations is 4mM, the best

7、 time is 24h. Betaine can increasing the proportion of S-phase cells, 18h is the best.Key words: Betaine；Lymphocytes proliferation；cell-cycle； 甜菜堿是一種季氨型生物堿，又名甘氨酸甜菜堿、三甲基甘氨酸等1，化學名稱為N-N-N-三甲基甘氨酸內(nèi)鹽2，結(jié)構簡式（CN3）3N+CH2COO-，其化學結(jié)構與氨基酸、膽堿相似3。甜菜堿本身是動物體內(nèi)的代謝中間產(chǎn)物，經(jīng)大量試驗證明，甜菜堿及其鹽類無毒、無害、無污染4，其小鼠半數(shù)致死量（LD50）在11000mg/kg

8、，對動物無致畸、致癌、致突變作用，是公認的安全物質(zhì)5，且能促進脂肪代謝，促進蛋白質(zhì)的合成6。淋巴細胞（lymphocyte）是免疫系統(tǒng)中較重要的細胞，在免疫應答中起關鍵作用7，有關報道指出甜菜堿有增強機體免疫的作用。本文研究了甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用及對細胞周期的影響。1 試驗材料1.1實驗儀器CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；流式細胞儀（美國Backman-Coulter公司）；Olympus IX70倒置顯微鏡（Olympus公司）；電子天平（Ohaus公司）；Bio-680型酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Gilson移液器（France）1.3實驗藥品與主要試劑甜菜堿（浙江綠成生

9、物技術有限公司）；ConA （Sigma公司）；MTT（Sigma公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；RPMI-1640（Gibco公司）；核糖核酸酶（Sigma公司）；PI（Sigma公司）1.3實驗動物BALB/c小鼠：兼用，體重(20±2.0)，由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，2試驗方法 2.1小鼠脾淋巴細胞分離以頸椎脫臼法處死小鼠，用 75乙醇浸泡小鼠15min，沿腹腔中線剪開小鼠胸腔，取出脾臟置于培養(yǎng)皿中，剪去脂肪和筋膜組織，用RPMI1640培養(yǎng)液漂洗，用注射器芯輕輕擠壓，用200目尼龍網(wǎng)過濾到玻璃離心管中，無菌PBS，1500 rpm離心5 min洗滌細胞兩次

10、，加入0.83的氯化胺到洗過的細胞中，靜置5min,以除去血紅細胞，用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌細胞兩次，以除去剩余的氯化胺，將上述收集到的脾臟細胞置于玻璃培養(yǎng)瓶中，在 37，5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h，以除去貼壁細胞，收集未貼壁的細胞懸液即獲得脾淋巴細胞。計數(shù)接種培養(yǎng)，臺盼藍染色計數(shù)，活細胞數(shù)大于95。2.2甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響（1）甜菜堿最佳濃度的考察：取小鼠脾淋巴細胞，調(diào)整細胞濃度為1.5×106個ml，100L/孔加入96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加入100L不同濃度的甜菜堿，甜菜堿的最終濃度分別為0.04mM、0.4mM、4mM、20mM，同時加入促細胞有絲

11、分裂原刀豆球蛋白（ConA），終濃度為0.1×10-3mM。設空白對照孔（不加任何藥物，只有細胞和培養(yǎng)液），同時設無細胞對照，以排除假陽性。每一濃度6個復孔。 置于37、5%CO2的飽和水蒸汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，每孔加22L新鮮配制的12mM 的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，輕輕吸取培養(yǎng)液上清150L，每孔加150L DMSO溶解MTT甲簪沉淀，用微型振蕩器振蕩混勻，用酶標儀于570nm波長讀取各孔光密度值。（2）最佳時間的考察：方法同上，只是將甜菜堿濃度定為上述實驗篩選出的最佳濃度，培養(yǎng)時間為12h、24h、48h、72h。2.3甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞周期分布的影響取小鼠脾淋巴細胞，調(diào)整

12、細胞濃度為1.5×107個ml，以1ml/孔加入24孔培養(yǎng)板，加入甜菜堿使其終濃度為4mM，設RPMI-1640培養(yǎng)基為陰性對照組。于4h、6h、18h、24h收集細胞。1500轉(zhuǎn)離心15min，細胞沉淀用70%乙醇懸浮，在4冰箱固定12小時以上。固定后的細胞用PBS洗兩遍并懸浮，加入0.8ml PI染液（生理鹽水 32.4ml；核糖核酸酶 0.5mg；Triton-x-100 0.25ml；PI 2.5mg；枸櫞酸鈉 50mg，加蒸餾水至50ml，4避光保存），搖均勻后于4，避光放置1小時，經(jīng)300目尼龍網(wǎng)過濾，在流式細胞儀上計數(shù)10,000個細胞，分別測定各個時間段各期細胞含量，

13、分析細胞周期。每組均重復三次。2.5統(tǒng)計分析用SPSS13.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析。3實驗結(jié)果 3.1甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響對甜菜堿不同濃度分析表明，甜菜堿終濃度0.4mM、4mM、20mM均可促淋巴細胞增值，但終濃度4mM效果最為明顯。對甜菜堿不同時間分析表明，在甜菜堿刺激24h、48h、72h后，淋巴細胞均可顯著增值，但隨時間的加倍，增值幅度并不明顯，綜合考慮，24h效果更好。因此甜菜堿4mM作用24h促淋巴細胞增殖最為理想。Table 1 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different conce

14、ntration（±，n=6）GroupDose(mM)OD value ControlConABetaine0.1×10-30.040.44200.25±0.010.39±0.01*0.29±0.01*0.35±0.02*0.37±0.01*0.36±0.01*p<0.05 vs control , *p<0.01 vs controlTable 2 Influence of Betaine on mouse splen- lymphocytes at different times（±，n

15、=6）TimesOD valueControl ConA Betaine12h24h48h72h0.26±0.01 0.31±0.02* 0.28±0.01* 0.25±0.01 0.37±0.01* 0.35±0.01* 0.25±0.01 0.38±0.01* 0.36±0.01*0.25±0.01 0.39±0.01* 0.38±0.01*p<0.05 vs control , *p<0.01 vs control3.2甜菜堿對小鼠脾淋巴細胞周期分布的影響由

16、不同時間點淋巴細胞周期與甜菜堿作用0小時比較分析表明，甜菜堿有誘導淋巴細胞由G0/G1期進入S期的作用，且作用18h效果最明顯，其G0/G1期由97.03%下降到89.99%，S期由2.58%升高到9.08%。到24h后，其誘導作用反而有些下降。（Table2）Table2 Influence of Betaine on the cell-cycle of mouse splen- lymphocytesat different times（±，n=3）TimesCell-cycle(%)G0/G1 S G2/M0h4h6h18h24h97.05±0.25 2.58

17、7;0.39 0.37±0.1496.60±0.28* 2.85±0.43* 0.55±0.1694.54±0.40* 4.83±0.28* 0.63±0.1490.23±0.36* 9.00±0.46* 0.77±0.2194.76±0.60* 4.34±0.31* 0.57±0.28*p<0.05 vs 0 h , *p<0.01 vs 0 h4討論 本實驗為小鼠脾淋巴細胞的體外實驗，是在小鼠脾淋巴細胞的分離及培養(yǎng)成功的前提下進行的，所以如何能更好的

18、分離出小鼠脾細胞，使其存活率最大且不產(chǎn)生污染是本實驗的關鍵。這里在前人工作的基礎上，不斷摸索，得出了取小鼠脾細胞較好的方法。淋巴細胞只有在某些活性物質(zhì)刺激下才能增殖，如美洲商陸絲裂原（PWM）8、刀豆蛋白（ConA）、脂多糖（PAS）等有絲分裂原9。本實驗發(fā)現(xiàn)甜菜堿在體外能促進小鼠脾淋巴細胞增殖。且濃度在4mM以內(nèi)，隨著藥物濃度的增大，細胞增殖越明顯，當濃度大于4mM時，細胞增殖作用反而下降。說明甜菜堿促淋巴細胞增殖作用有一定濃度限制，其最佳濃度為4mM，指導了以后實驗的給藥濃度。甜菜堿促淋巴細胞增殖作用在24h時效果最明顯，為以后試驗時間的設計提供了參考。細胞增殖是有周期性的，也就是具有細胞

19、周期10。一個細胞周期包括：G0（休止期），細胞處于休止狀態(tài)；G1（DNA合成前期），完成RNA與蛋白質(zhì)合成；S（DNA合成期），完成DNA合成；G2（DNA合成后期），完成RNA與蛋白質(zhì)合成；M（細胞分裂期），完成 染色體裝配11。流式細胞儀對細胞周期的分析主要是對單個細胞內(nèi)DNA含量的分析12，通過標記物（PI）發(fā)出紅色熒光的強弱可推算出G0/G1期(二倍體)，S期(超二倍體)，G2/M期(四倍體)的比例13，其敏感性和特異性均超過其它方法。通過分析可知甜菜堿有促進淋巴細胞由G0/G1期進入S期的作用，且作用18h效果最明顯。說明甜菜堿促使小鼠脾淋巴細胞由G0/G1期進入S期而起

20、到促淋巴細胞增殖的作用。參考文獻：1Kiene RP.Uptake of Choline and Its Conversion to Glycine Betaine by Bacteria in Estuarine WatersJ.Appl Environ Microbiol.1998 64(3):1045 -1051. 2Go EK, Jung KJ, Kim JY, et al. Betaine suppresses proinflammatory signaling during aging: the involvement of nuclear factor-kappaB via nu

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22、on W, Elmslie J, Lever M, et al. Dietary and supplementary betaine: acute effects on plasma betaine and homocysteine concentrations under standard and postmethionine load conditions in healthy male subjectsJ.Am J Clin Nutr. 2008, 87(3):577-85.5Ji C,Kaplowitz N. Betaine decreases hyperhomocysteinemia

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