枸杞延緩小鼠皮膚老化的實驗研究

1、枸杞延緩小鼠皮膚老化的實驗研究                作者：張華 于學文 楊學東 白秀珍【摘要】  目的： 探討枸杞延緩皮膚老化作用及其作用機制。方法： 昆明種小白鼠頸部注射D?舶肴樘牽?復制亞急性衰老模型。用黃嘌呤氧化酶法測定皮膚SOD活力，用硫代巴比妥酸（TBA）法測定皮膚MDA的量，用堿水解法測定皮膚HOP含量，用HE染色法觀察皮膚組織形態(tài)學改變。結(jié)果：給藥組小鼠皮膚SOD活性明顯增加，MDA含量明顯降低，膠原蛋白含量明顯

2、增加，皮膚組織形態(tài)學檢查結(jié)果與衰老模型組比較顯示真皮層成纖維細胞數(shù)量增加，膠原纖維排列緊密，排列較規(guī)則。結(jié)論： 枸杞可以延緩皮膚老化，濃度低于20%時其作用隨劑量增加而增強，當濃度高于20%時其延緩老化作用隨劑量增大而減弱。論文論文參考網(wǎng) 【關(guān)鍵詞】  枸杞水煎劑； 皮膚老化； D?舶肴樘牽? SOD； MDA； HOP皮膚老化是整個機體衰老在皮膚上的反應，隨著年齡的增加，衰老的最直觀的變化即為皮膚。皮膚衰老不僅有損于美容，且與許多皮膚病如脂溢性角化、日光性角化、基底細胞癌、鱗狀細胞癌的發(fā)生也有著病因?qū)W的關(guān)系。因此，預防和延緩皮膚衰老已成為生命科學研究的熱點之一。本研究觀察了外用枸杞

3、水煎劑對D?舶肴樘撬?致亞急性衰老模型小鼠皮膚的作用，為中醫(yī)藥化妝品發(fā)展提供基礎(chǔ)資料。1  材料1?1  藥品外用枸杞水煎劑的制備: 取寧夏枸杞子100g，用四分法將其縮減至50g，60干燥后粉碎，稱取40g粉末加10倍量80%乙醇冷凝回流提取2次，每次1h（保持微沸），8層紗布過濾；將藥渣加8倍量水繼續(xù)冷凝回流提取3次，每次1h（保持微沸），收集濾液；合并3次濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至50ml。分別取一定量稀釋至所需濃度(1%、10%、20%、40%、80%)，加入一定量的氮酮（Azone）使氮酮濃度達到3%，備用。SOD、MDA、HOP試劑盒、考馬斯亮藍液均購于南京建成

4、生物研究所;D?舶肴樘槍河?amresco公司;寧夏枸杞購于遼西國藥店;其它試劑均為國產(chǎn)分析純。1?2  實驗動物昆明小白鼠80只月齡，雌雄各半，體重2630g，購自遼寧醫(yī)學院實驗動物中心。1?3  儀器UV751?GD型紫外可見分光光度計（上海欣益儀器儀表有限公司）；脫水機、包埋機、切片機、染色機（英國SHANDON公司）   ；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE?52（上海安亭電子儀器廠）；FDV高速風選式超細粉碎機（臺灣佑崎機械制造公司）；高速離心機（上海手術(shù)儀器廠）；電熱恒溫水浴箱（北京光明醫(yī)療儀器廠）；XH?B型旋渦混勻器（姜堰市康健醫(yī)療器具有限公司）；BS223

5、S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。2  方法2?1  實驗動物分組昆明小白鼠隨機分成8組，每組10只，自由食水1w后, 背部剃毛2×2cm區(qū)域，以后每5天剃毛一次。按照表1給予處理因素,連續(xù)50d。表1  實驗動物分組（略）  2?2  取材末次給藥后將受試區(qū)域的被毛徹底剃干凈，烏拉坦(1.5g/kg)麻醉取皮膚。2?3  生化指標的測定2?3?1  皮膚SOD 、MDA含量的測定  0的生理鹽水中去除皮下脂肪，濾紙拭干，按1：9的比例制生理鹽水相皮膚勻漿液，3000rpm離心15min，取上

6、清備用，按試劑盒說明進行操作。2?3?2  皮膚HOP含量的測定  乙醚消化皮下脂肪，濾紙拭干，按照試劑盒說明，堿水解法測皮膚HOP含量。2?4  組織學觀察取受試皮膚，10福爾馬林固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，普通顯微鏡下進行組織學觀察。2?5  數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析。論文參考網(wǎng) 3  結(jié)果3?1  皮膚SOD 、MDA含量表2  皮膚SOD 、MDA含量（略）注：與對照組比較, #P<0.01；與衰老組和氮酮組比較,*P<0.05，*P<0.01。3?2&#

7、160; 皮膚HOP含量及膠原蛋白含量表3  皮膚HOP含量及膠原蛋白含量（略）注：與對照組比較, #P<0.01；與衰老組和氮酮組比較,*P<0.05，*P<0.01圖1  對照組 （×400）（略）圖2  衰老組（×400）（略）圖3  給藥組（×400）（略）3?3  皮膚形態(tài)學觀察衰老組(圖2)與對照組(圖1)比較，膠原纖維染色減弱，纖維變細且排列稀疏，表明膠原纖維合成減少；表皮厚度變薄，角質(zhì)層變厚。給藥組(圖3)與衰老組(圖2)比較，膠原纖維合成較模型組明顯增加，表皮厚度增厚，角質(zhì)層變薄

8、；真皮層成纖維細胞數(shù)量增加。4  討論老年動物飼養(yǎng)周期長，個體差異大，不易獲得。而青年小鼠長期注射D?舶肴樘牽?由于其代謝產(chǎn)物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內(nèi)，影響滲透壓，導致細胞腫脹，代謝紊亂，體內(nèi)活性氧水平升高，細胞脂質(zhì)受損，以致產(chǎn)生機體多器官、多系統(tǒng)的功能減退，這些變化均與老齡小鼠相似。故本實驗采用了D?舶肴樘撬?致的小鼠衰老模型1。由表2、表3可知，連續(xù)頸部注射D?舶肴樘?50d后,其皮膚SOD值與對照組比較明顯降低(P<0.01),MDA值與對照組比較明顯升高(P<0.01);膠原蛋白含量明顯增加(P<0.01)。由圖2和圖1比較可知膠原纖維染色減弱

9、，纖維變細且排列稀疏；表皮厚度變薄，角質(zhì)層變厚。表明衰老模型制造成功。氮酮是近年來應用較為普遍的一種透皮吸收促進劑。其特點是無色無臭，對人體粘膜產(chǎn)生最低刺激，有效濃度低，對親水親油性藥物均有促進作用。它是通過增加角質(zhì)層類脂流動和溶解皮膚的類脂來增加藥物的透皮吸收2。本實驗在不同濃度的枸杞水煎劑中加入3的促滲劑氮酮，使藥效得到充分發(fā)揮。皮膚老化是機體衰老的外在反映，機體的衰老源于細胞的衰老。關(guān)于皮膚的衰老學說有很多，1956年，Harman D3提出了衰老的自由基學說，該學說認為衰老是由于自由基引起的對細胞成分的進攻造成的結(jié)果，維持體內(nèi)適當水平的抗氧化劑和自由基清除劑水平，可以延長壽命和推遲衰老

10、。自由基具有極強的氧化能力，可使生物膜中不飽和脂類發(fā)生過氧化，形成過氧化脂質(zhì)，其終產(chǎn)物MDA是強的交聯(lián)劑，與蛋白質(zhì)、核酸或脂類結(jié)成難溶性物質(zhì)，使生物膜硬化導致通透性降低，影響細胞物質(zhì)交換，繼而使之破裂、死亡。而SOD是最有效的抗氧化劑和自由基清除劑，SOD的活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。本實驗給藥組皮膚SOD值明顯高于衰老組(P<0.01)，MDA值明顯低于衰老組(P<0.01)，提示枸杞水煎劑能夠激活內(nèi)源性防御自由基損傷的物質(zhì),抑制自由基。皮膚由表皮和真皮組成。表皮的基底層細胞不斷地進行細胞分裂，分裂后的細胞不斷地分化為其他各種表皮細胞，最后形成角質(zhì)層細胞。隨著年齡增

11、加，基底層細胞的分裂速度降低，導致表皮中老化的細胞增多，角質(zhì)層增厚和表面較粗糙等表皮老化現(xiàn)象。由圖3可知，給藥組的角質(zhì)層與表皮厚度的比例小于衰老組，這一結(jié)果證明枸杞水煎劑外用能使基底層細胞進行細胞分裂,使表皮的角質(zhì)層細胞以外的其他細胞延緩分化為角質(zhì)細胞，從而使表皮延緩衰老。膠原纖維是真皮中的主要成分之一，具有支持、連接等作用。膠原纖維的主要成分是膠原蛋白，對維持皮膚的張力和彈性起重要作用。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，約占膠原蛋白全部氨基酸殘基的13.4。隨著年齡增加，體內(nèi)SOD等清除自由基能力下降，自由基大量增加可引起膠原蛋白交聯(lián)、老化、失去彈性。本實驗顯示，枸杞外用可使膠原纖維的體密度增加，從形態(tài)學的角度證明了枸杞外用能使真皮的膠原纖維更新，它較生化指標的測定具有更直接、客觀的實際意義。綜上所述，枸杞水煎劑對皮膚有延緩衰老作用,其作用可能是通過下列途徑進行：增強和調(diào)節(jié)機體免疫功能，激活內(nèi)源性防御自由基損傷的物質(zhì)SOD，抑制自由基；對表皮是通過刺激表皮細胞分裂進行的；對真皮通過作用于成纖維細胞和微血管，增加膠原蛋白合成，從而延緩皮膚衰老。 【參考文獻】  1 龔國清,徐磅本. 小鼠衰老模型研究. 中國藥科大學學報，1991，22（2）：101?2 胡晉紅, 陳崗, 朱宇. 藥物透皮吸收促進劑及其聯(lián)合應用. 國外醫(yī)學