細(xì)胞生物學(xué)的研究方法學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1第一頁，共166頁。第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法Technology for Cell Biology第一節(jié)第一節(jié)第二節(jié)第二節(jié)第三節(jié)第三節(jié)中英文中英文退退 出出第四節(jié)第四節(jié)第五節(jié)第五節(jié)第六節(jié)第六節(jié)第1頁/共166頁第二頁，共166頁。一、光學(xué)顯微一、光學(xué)顯微(xin wi)鏡技術(shù)鏡技術(shù)二、電子顯微二、電子顯微(xin wi)鏡技術(shù)鏡技術(shù)三、納米顯微三、納米顯微(xin wi)技術(shù)技術(shù)四、超分辨光學(xué)顯微四、超分辨光學(xué)顯微(xin wi)技術(shù)技術(shù)退退 出出首首 頁頁Technology for Cell Biology第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo

2、)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第2頁/共166頁第三頁，共166頁。一、光學(xué)一、光學(xué)(gungxu)顯顯微鏡技術(shù)微鏡技術(shù)Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第3頁/共166頁第四頁，共166頁。一、光學(xué)一、光學(xué)(gungxu)顯顯微鏡技術(shù)微鏡技術(shù)不同不同(b tn)顯微結(jié)構(gòu)的尺寸顯微結(jié)構(gòu)的尺寸由左至右依次為動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、線粒體、流感病毒、核由左至右依次為動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、線粒體、流感病毒、核糖體、綠色熒光蛋白、胸腺嘧啶。虛線為

3、光學(xué)顯微鏡分辨糖體、綠色熒光蛋白、胸腺嘧啶。虛線為光學(xué)顯微鏡分辨極限。極限。Cell,2010(143):1047-1058退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法第4頁/共166頁第五頁，共166頁。2.分辨率公式分辨率公式(gngsh)n = 聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)(jizh)的折射的折射 率，空氣為率，空氣為1，油為，油為1.5。= 標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角，標(biāo)本對(duì)物鏡鏡口張角的半角， sin的最大值為的最大值為1。= 照明光源的波長(zhǎng)，白光照明光源的波長(zhǎng)，白光0.5 m 。橫向橫向(hn

4、 xin)分辨率分辨率 Rx,y=0.61/nsin 縱向分辨率縱向分辨率 Rz=2/(nsin)2 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法( (一一) )普通光學(xué)顯微鏡的分辨率普通光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第5頁/共166頁第六頁，共166頁。戊二醛戊二醛甲醛甲醛退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法( (一一) )普通普通(ptng)(ptng)光學(xué)顯微鏡的分辨率光學(xué)顯微鏡

5、的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第6頁/共166頁第七頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法( (一一) )普通普通(ptng)(ptng)光學(xué)顯微鏡的分辨率光學(xué)顯微鏡的分辨率一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第7頁/共166頁第八頁，共166頁。組織切片制備組織切片制備(zhbi)過程過程退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第8頁/共166頁第九頁

6、，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第9頁/共166頁第十頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、光學(xué)一、光學(xué)(gungxu)顯微鏡技術(shù)顯微鏡技術(shù)第10頁/共166頁第十一頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第11頁/共166

7、頁第十二頁，共166頁。熒光素?zé)晒馑?fluorescein)，綠色熒光綠色熒光四甲基羅丹明四甲基羅丹明(tetramethyrhodanmine)，紅色熒光紅色熒光退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第12頁/共166頁第十三頁，共166頁。( (二二) )熒光顯微鏡可以呈現(xiàn)熒光顯微鏡可以呈現(xiàn)(chngxin)(chngxin)強(qiáng)反差的彩色圖強(qiáng)反差的彩色圖像像2.熒光熒光(ynggung)顯微鏡工作顯微鏡工作原理原理熒光熒光(ynggung)顯微鏡顯微鏡（fluorescence

8、microscope）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： 以高壓汞燈和弧光作為光源。以高壓汞燈和弧光作為光源。兩組濾光片。兩組濾光片。熒光熒光(ynggung)顯微顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)鏡的光學(xué)系統(tǒng)退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第13頁/共166頁第十四頁，共166頁。( (二二) )熒光熒光(ynggung)(ynggung)顯微鏡可以呈現(xiàn)強(qiáng)反差的彩色圖顯微鏡可以呈現(xiàn)強(qiáng)反差的彩色圖像像3.應(yīng)用應(yīng)用成像反差強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高。成像反差強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高。 定性、定位定性、定位(dng

9、wi)和定量的研究組織內(nèi)的熒光標(biāo)和定量的研究組織內(nèi)的熒光標(biāo)記物質(zhì)。記物質(zhì)。對(duì)活細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。對(duì)活細(xì)胞內(nèi)分子的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀察。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第14頁/共166頁第十五頁，共166頁。( (三三) )相差顯微鏡通常被用于觀察相差顯微鏡通常被用于觀察(gunch)(gunch)活細(xì)胞活細(xì)胞波長(zhǎng)變波長(zhǎng)變化化振幅變振幅變化化光速變光速變化化顏色變化顏色變化明暗變化明暗變化相位變化相位變化人眼能感知人眼能感知人眼不

10、能感知人眼不能感知原理原理(yunl)：退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第15頁/共166頁第十六頁，共166頁。( (三三) )相差相差(xin ch)(xin ch)顯微鏡通常被用于觀察活細(xì)顯微鏡通常被用于觀察活細(xì)胞胞應(yīng)用：活細(xì)胞應(yīng)用：活細(xì)胞(xbo)觀察觀察退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第16頁/共166頁第十

11、七頁，共166頁。相差顯微鏡觀察培養(yǎng)相差顯微鏡觀察培養(yǎng)(piyng)中的中的HeLa細(xì)胞細(xì)胞退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第17頁/共166頁第十八頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第18頁/共166頁第十九頁，共166頁。原理：散射光成像。原理：散射光成像。應(yīng)用應(yīng)用(yngyng)(yngyng)：分辨率不：分辨率不高。高。適合觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、適合觀

12、察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和真菌等。和真菌等。 ( (四四) )暗視野顯微鏡通過暗視野顯微鏡通過(tnggu)(tnggu)散射光成像散射光成像暗視野顯微鏡工作暗視野顯微鏡工作(gngzu)原理原理退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第19頁/共166頁第二十頁，共166頁。( (五五) )顯微電影攝影顯微電影攝影(shyng)(shyng)技術(shù)記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)過技術(shù)記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)過程程 原理：用顯微電影攝影原理：用

13、顯微電影攝影(shyng)(shyng)術(shù)或電視錄像以一定時(shí)間間術(shù)或電視錄像以一定時(shí)間間隔拍攝。隔拍攝。應(yīng)用：準(zhǔn)確記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)過程和速度。應(yīng)用：準(zhǔn)確記錄細(xì)胞或細(xì)胞器的運(yùn)動(dòng)過程和速度。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、光學(xué)一、光學(xué)(gungxu)顯顯微鏡技術(shù)微鏡技術(shù)第20頁/共166頁第二十一頁，共166頁。原理：原理：?jiǎn)紊す庾鳛楣庠?。單色激光作為光源。共聚焦：物鏡和聚光鏡互相共焦點(diǎn)，只有從標(biāo)本焦面共聚焦：物鏡和聚光鏡互相共焦點(diǎn)，只有從標(biāo)本焦面發(fā)出的光線聚焦成像，焦面以

14、外發(fā)出的光線聚焦成像，焦面以外(ywi)(ywi)的漫射光的漫射光不參加成像。不參加成像。逐點(diǎn)掃描。逐點(diǎn)掃描。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第21頁/共166頁第二十二頁，共166頁。應(yīng)用：進(jìn)行應(yīng)用：進(jìn)行(jnxng)(jnxng)連續(xù)的光學(xué)切片，通過電腦進(jìn)連續(xù)的光學(xué)切片，通過電腦進(jìn)行行(jnxng)(jnxng) 三維重建。三維重建。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xb

15、o)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)第22頁/共166頁第二十三頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第23頁/共166頁第二十四頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第24頁/共166頁第二十五頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)

16、研究(ynji)(ynji)方法方法第25頁/共166頁第二十六頁，共166頁。二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)(jsh)退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第26頁/共166頁第二十七頁，共166頁。(一一)透射透射(tu sh)電子顯微鏡（電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM ）光學(xué)顯微鏡與透射光學(xué)顯微鏡與透射(tu sh)電子顯微鏡的比較電子顯微鏡的比較退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三

17、章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第27頁/共166頁第二十八頁，共166頁。( (一一) )透射透射(tu sh)(tu sh)電子顯微鏡電子顯微鏡退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第28頁/共166頁第二十九頁，共166頁。( (一一) )透射透射(tu sh)(tu sh)電子顯微鏡電子顯微鏡退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三

18、章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第29頁/共166頁第三十頁，共166頁?？茖W(xué)(kxu)Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第30頁/共166頁第三十一頁，共166頁?？茖W(xué)(kxu)Scientific American 中文版退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生

19、物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第31頁/共166頁第三十二頁，共166頁。掃描電鏡的工作掃描電鏡的工作(gngzu)原理原理 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第32頁/共166頁第三十三頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第33頁/共166頁第三十四頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章

20、第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第34頁/共166頁第三十五頁，共166頁。( (三三) )透射電子顯微鏡借助金屬投影、冰凍斷裂及冰凍透射電子顯微鏡借助金屬投影、冰凍斷裂及冰凍蝕刻技術(shù)可獲取蝕刻技術(shù)可獲取(huq)(huq)三維圖像三維圖像1.金屬投影法（金屬投影法（metal shadowing） 原理：以一定的傾斜角度向樣品表面噴重金屬，顯示原理：以一定的傾斜角度向樣品表面噴重金屬，顯示 投影效果，給出樣品表面三維結(jié)構(gòu)。投影效果，給出樣品表面三維結(jié)構(gòu)。 應(yīng)用：觀察蛋白、核酸應(yīng)用：觀察蛋白、核酸(h sun)類大分子，病毒顆粒及細(xì)類大分子，病毒顆粒及細(xì)胞壁胞壁

21、 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第35頁/共166頁第三十六頁，共166頁。2.冰凍冰凍(bngdng)斷裂（斷裂（freeze-fracture） 樣品快速冷凍樣品快速冷凍 冰刀從脂雙層疏水部分撬開冰刀從脂雙層疏水部分撬開 暴露膜內(nèi)部構(gòu)造暴露膜內(nèi)部構(gòu)造 樣品樣品(yngpn)制制備：備：應(yīng)用：觀察細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)應(yīng)用：觀察細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)(jigu)(jigu)的內(nèi)部構(gòu)造。的內(nèi)部構(gòu)造。 退退 出出Technology for Cell Biology首

22、首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第36頁/共166頁第三十七頁，共166頁。2.冰凍冰凍(bngdng)斷裂（斷裂（freeze-fracture） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)(jsh)第37頁/共166頁第三十八頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第

23、38頁/共166頁第三十九頁，共166頁。3.冰凍蝕刻（冰凍蝕刻（freeze-etch）冷凍組織冷凍組織 冰刀撬組織冰刀撬組織 真空中升華真空中升華 暴露膜結(jié)構(gòu)暴露膜結(jié)構(gòu) 應(yīng)用：觀察應(yīng)用：觀察(gunch)細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞的內(nèi)部構(gòu)造。構(gòu)造。 樣品樣品(yngpn)制備：制備：退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)第39頁/共166頁第四十頁，共166頁。3.冰凍蝕刻（冰凍蝕刻（freeze-etch）退退 出出Technology for Cell Bi

24、ology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、電子顯微鏡技術(shù)二、電子顯微鏡技術(shù)(jsh)第40頁/共166頁第四十一頁，共166頁。冰凍蝕刻顯示昆蟲肌肉細(xì)胞中的蛋白冰凍蝕刻顯示昆蟲肌肉細(xì)胞中的蛋白(dnbi)(dnbi)纖維纖維退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第41頁/共166頁第四十二頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynj

25、i)方法方法第42頁/共166頁第四十三頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第43頁/共166頁第四十四頁，共166頁。1.掃描掃描(somio)隧道顯微鏡（隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope,STM）原理：使用原子尺度的探針在標(biāo)本原理：使用原子尺度的探針在標(biāo)本(biobn)(biobn)的表面進(jìn)行掃的表面進(jìn)行掃描，在探針描，在探針 針尖和樣品間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本針尖和樣品間施加一定電壓，產(chǎn)生隨標(biāo)本(biobn)(biobn)

26、表面形貌變表面形貌變 化的隧道電流?；乃淼离娏?。特點(diǎn)：分辨率高，可在大氣和液體等非真空狀態(tài)下工作。特點(diǎn)：分辨率高，可在大氣和液體等非真空狀態(tài)下工作。 應(yīng)用：直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)，如應(yīng)用：直接觀察大分子的三維結(jié)構(gòu)，如DNADNA雙螺旋結(jié)構(gòu)雙螺旋結(jié)構(gòu) 。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法 三、納米顯微技術(shù)三、納米顯微技術(shù)第44頁/共166頁第四十五頁，共166頁。1.掃描掃描(somio)隧道顯微鏡（隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope,STM）掃描

27、隧道顯微鏡下的人紅細(xì)胞血影退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法 三、納米顯微三、納米顯微(xin wi)技術(shù)技術(shù)第45頁/共166頁第四十六頁，共166頁。2.原子力顯微鏡（原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）原理：通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲原理：通過分析探針針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所取所 觀察表面的微觀信息。觀察表面的微觀信息。 特點(diǎn)：可以在三態(tài)（固態(tài)、氣態(tài)和液態(tài)）特點(diǎn)：可以在三態(tài)（固態(tài)、氣態(tài)和液態(tài)） 狀況下工作。狀況下

28、工作。應(yīng)用：活細(xì)胞表面及生物大分子應(yīng)用：活細(xì)胞表面及生物大分子(fnz)空間伸展及其結(jié)晶空間伸展及其結(jié)晶體表面觀測(cè)體表面觀測(cè) 進(jìn)行單個(gè)分子進(jìn)行單個(gè)分子(fnz)操作。操作。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法 三、納米三、納米(n m)顯微技術(shù)顯微技術(shù)第46頁/共166頁第四十七頁，共166頁。2.原子力顯微鏡原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）針尖的曲率半徑通常為針尖的曲率半徑通常為5-10nm5-10nm退退 出出Technology for Cel

29、l Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法 三、納米三、納米(n m)顯微技術(shù)顯微技術(shù)第47頁/共166頁第四十八頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第48頁/共166頁第四十九頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第49頁/共166頁第五十頁，共166頁。由光的衍射效應(yīng)導(dǎo)致的光學(xué)顯微鏡分

30、辨率極限由光的衍射效應(yīng)導(dǎo)致的光學(xué)顯微鏡分辨率極限(jxin)稱稱 為為Abbe限度限度(Abbe limit)。應(yīng)用新的光學(xué)原理、發(fā)光應(yīng)用新的光學(xué)原理、發(fā)光/示蹤分子和信號(hào)分析示蹤分子和信號(hào)分析 技術(shù)，建立起了能夠突破技術(shù)，建立起了能夠突破Abbe限度的超分辨顯限度的超分辨顯 微技術(shù)，使光學(xué)顯微鏡的分辨率達(dá)到了微技術(shù)，使光學(xué)顯微鏡的分辨率達(dá)到了3050nm 的納米尺度。的納米尺度。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第50頁/共166頁第五十一頁，共166頁。光的衍射效應(yīng)使物鏡的焦點(diǎn)呈

31、橢圓形光的衍射效應(yīng)使物鏡的焦點(diǎn)呈橢圓形(左左)；當(dāng)兩點(diǎn)間的距離大于衍射限；當(dāng)兩點(diǎn)間的距離大于衍射限度時(shí)，物鏡能夠呈現(xiàn)度時(shí)，物鏡能夠呈現(xiàn)(chngxin)兩個(gè)像，如兩根微管的橫切面兩個(gè)像，如兩根微管的橫切面A；當(dāng)；當(dāng)兩點(diǎn)間的距離小于衍射限度時(shí)，物鏡不能夠呈現(xiàn)兩點(diǎn)間的距離小于衍射限度時(shí)，物鏡不能夠呈現(xiàn)(chngxin)兩個(gè)像，兩個(gè)像，如兩根微管的橫切面如兩根微管的橫切面B。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第51頁/共166頁第五十二頁，共166頁。STED顯微技術(shù)成像與共焦顯微技術(shù)成

32、像與共焦顯微技術(shù)成像比較顯微技術(shù)成像比較以線粒體膜蛋白以線粒體膜蛋白TOM20為為標(biāo)志蛋白，左上為共焦顯標(biāo)志蛋白，左上為共焦顯微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)(jigu)，右上為，右上為STED顯顯微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)微鏡呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)(jigu)。左下為。左下為TOM2和和線粒體基質(zhì)蛋白線粒體基質(zhì)蛋白HSP70在在共焦顯微鏡下呈現(xiàn)的線粒共焦顯微鏡下呈現(xiàn)的線粒體結(jié)構(gòu)體結(jié)構(gòu)(jigu)。右下為由。右下為由STED技術(shù)重建的線粒體三技術(shù)重建的線粒體三維結(jié)構(gòu)維結(jié)構(gòu)(jigu)。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研

33、究(ynji)(ynji)方法方法第52頁/共166頁第五十三頁，共166頁。SIM顯微技術(shù)顯微技術(shù)(jsh)成像成像與共焦顯微技術(shù)與共焦顯微技術(shù)(jsh)成成像比較像比較將核孔復(fù)合體標(biāo)記成紅色，將核孔復(fù)合體標(biāo)記成紅色，核纖層蛋白核纖層蛋白B標(biāo)記成綠色、標(biāo)記成綠色、DNA標(biāo)記成藍(lán)紫色，用共標(biāo)記成藍(lán)紫色，用共焦顯微鏡呈現(xiàn)的細(xì)胞核中焦顯微鏡呈現(xiàn)的細(xì)胞核中間位置橫切面結(jié)構(gòu)，小圖間位置橫切面結(jié)構(gòu)，小圖為方框內(nèi)的細(xì)微結(jié)構(gòu)為方框內(nèi)的細(xì)微結(jié)構(gòu)(上上)；相同方法標(biāo)記細(xì)胞核，相同方法標(biāo)記細(xì)胞核，SIM技術(shù)技術(shù)(jsh)三維重建三維重建后呈現(xiàn)的細(xì)胞核中間位置后呈現(xiàn)的細(xì)胞核中間位置橫切面結(jié)構(gòu)。橫切面結(jié)構(gòu)。退退 出出

34、Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第53頁/共166頁第五十四頁，共166頁。第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞的分離細(xì)胞的分離(fnl)(fnl)和培養(yǎng)和培養(yǎng) 一、細(xì)胞分離一、細(xì)胞分離二、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞培養(yǎng)離心方法離心方法 流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 免疫磁珠法免疫磁珠法 激光捕獲顯微切割技術(shù)激光捕獲顯微切割技術(shù) 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第54頁/共166頁第五十五頁，共166頁。一、不同一

35、、不同(b tn)類型細(xì)胞類型細(xì)胞的分離的分離胰蛋白酶、膠原酶胰蛋白酶、膠原酶EDTA消除細(xì)胞間的連消除細(xì)胞間的連接和細(xì)胞外基質(zhì)接和細(xì)胞外基質(zhì) 細(xì)胞分離需根據(jù)細(xì)胞分離需根據(jù)(gnj)不同細(xì)胞的特征采用不同不同細(xì)胞的特征采用不同的方法。的方法。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法第55頁/共166頁第五十六頁，共166頁。一、不同類型細(xì)胞一、不同類型細(xì)胞(xbo)的分離的分離( (一一) )離心方法離心方法 利用細(xì)胞的密度利用細(xì)胞的密度(md)(md)特性可有效分離不同的細(xì)胞。如特性可有效分離不同的細(xì)胞。如

36、血漿白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離。血漿白細(xì)胞和紅細(xì)胞的分離。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第56頁/共166頁第五十七頁，共166頁。流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞儀（flow cytometer）：從多細(xì)胞懸）：從多細(xì)胞懸 液中分離目的液中分離目的(md)細(xì)胞的精密儀器。細(xì)胞的精密儀器。 樣品處理：用帶有熒光的特異抗體標(biāo)記待分離樣品處理：用帶有熒光的特異抗體標(biāo)記待分離 的細(xì)胞。的細(xì)胞。分離速度：分離速度：2萬個(gè)細(xì)胞萬個(gè)細(xì)胞/s 。 分離純度：分離純度：95% 。( (二二) )流式細(xì)胞術(shù)流式

37、細(xì)胞術(shù)退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同類型一、不同類型(lixng)細(xì)胞細(xì)胞的分離的分離第57頁/共166頁第五十八頁，共166頁。( (二二) )流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù)Beckman FC500 流式細(xì)胞儀外形流式細(xì)胞儀外形(wi xn)流式細(xì)胞儀工作流式細(xì)胞儀工作(gngzu)原理原理退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同類型細(xì)胞的分離一、不同類型細(xì)胞的

38、分離第58頁/共166頁第五十九頁，共166頁。Beckman FC500 流式細(xì)胞儀分析流式細(xì)胞儀分析(fnx)結(jié)果結(jié)果退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第59頁/共166頁第六十頁，共166頁。( (三三) )免疫免疫(miny)(miny)磁珠法磁珠法 利用帶有特定單抗的免疫利用帶有特定單抗的免疫(miny)磁珠磁珠（immunomagnetic microsphere）與靶細(xì)胞的特異結(jié)）與靶細(xì)胞的特異結(jié)合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)胞分離出來。合，快速地從多細(xì)胞懸液中將目的細(xì)

39、胞分離出來。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同類型細(xì)胞的分離一、不同類型細(xì)胞的分離第60頁/共166頁第六十一頁，共166頁。( (三三) )免疫免疫(miny)(miny)磁珠法磁珠法 分離分離(fnl)純度：純度：9599 Fe2O3或或Fe3O4顆粒顆粒 + 單克隆抗體單克隆抗體 免疫磁珠免疫磁珠退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、不同類型細(xì)胞的分離一、不

40、同類型細(xì)胞的分離第61頁/共166頁第六十二頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法一、不同一、不同(b tn)類型細(xì)胞類型細(xì)胞的分離的分離第62頁/共166頁第六十三頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法一、不同一、不同(b tn)類型細(xì)胞類型細(xì)胞的分離的分離第63頁/共166頁第六十四頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell

41、 Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第64頁/共166頁第六十五頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第65頁/共166頁第六十六頁，共166頁。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第66頁/共166頁第六十七頁，共166頁。CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱相差顯微鏡超凈工作臺(tái)退退 出出Technology fo

42、r Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第67頁/共166頁第六十八頁，共166頁。2.原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(piyng)和傳代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)(piyng)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)(piyng)（primary culture）：直接?。褐苯尤〔挠谟袡C(jī)材于有機(jī) 體組織的細(xì)胞培養(yǎng)體組織的細(xì)胞培養(yǎng)(piyng)。傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)(piyng)（secondary culture）：原代）：原代培養(yǎng)培養(yǎng)(piyng)的細(xì)的細(xì) 胞從培養(yǎng)胞從培養(yǎng)(piyng)瓶中取出，以瓶中取出，以1:2以上的以上的比例的擴(kuò)比例的擴(kuò) 大培養(yǎng)大培養(yǎng)(piyng

43、)。傳代培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)(piyng)的細(xì)的細(xì)胞通常表現(xiàn)出其來源胞通常表現(xiàn)出其來源 組織的分化特征。組織的分化特征。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞培養(yǎng)第68頁/共166頁第六十九頁，共166頁。3.細(xì)胞系細(xì)胞系細(xì)胞系（細(xì)胞系（cell line）：在培養(yǎng)）：在培養(yǎng)(piyng)的細(xì)胞中產(chǎn)生的細(xì)胞中產(chǎn)生“不死不死”的的 變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可以無限繁殖、傳代。變異細(xì)胞，這種細(xì)胞可以無限繁殖、傳代。細(xì)胞系的來源包括培養(yǎng)細(xì)胞系的來源包括培養(yǎng)(piyng)過程中發(fā)生轉(zhuǎn)

44、化的正常細(xì)胞和過程中發(fā)生轉(zhuǎn)化的正常細(xì)胞和取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)取材于腫瘤組織的原代培養(yǎng)(piyng)細(xì)胞。細(xì)胞。細(xì)胞株（細(xì)胞株（cell strain）：用細(xì)胞克隆化的方法進(jìn)一步改）：用細(xì)胞克隆化的方法進(jìn)一步改 善細(xì)胞系的均一性，即分離出單個(gè)細(xì)胞使之增殖善細(xì)胞系的均一性，即分離出單個(gè)細(xì)胞使之增殖 形成的細(xì)胞群。形成的細(xì)胞群。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法 二、細(xì)胞培養(yǎng)二、細(xì)胞培養(yǎng)第69頁/共166頁第七十頁，共166頁。一、細(xì)胞裂解一、細(xì)胞裂解二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)離心二、細(xì)

45、胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)離心三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定四、核酸四、核酸(h sun)的分離純化與鑒定的分離純化與鑒定退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第70頁/共166頁第七十一頁，共166頁。一、細(xì)胞一、細(xì)胞(xbo)(xbo)裂解裂解在細(xì)胞組分的分級(jí)離心前，首先破碎細(xì)胞，制備細(xì)胞勻在細(xì)胞組分的分級(jí)離心前，首先破碎細(xì)胞，制備細(xì)胞勻漿液。漿液。方法：方法： 低滲透壓；低滲透壓； 超聲振蕩；超聲振蕩； 強(qiáng)制通過強(qiáng)制通過(tnggu)微孔；微孔； 機(jī)械破碎及研磨；機(jī)械破碎及研

46、磨； 去垢劑：如去垢劑：如SDS、TritonX-100、NP-40 常用于蛋白質(zhì)的抽提；常用于蛋白質(zhì)的抽提； 離液劑：如鹽酸胍、尿素離液劑：如鹽酸胍、尿素 常用于細(xì)胞常用于細(xì)胞DNA和和RNA的抽提。的抽提。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第71頁/共166頁第七十二頁，共166頁。二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)(fn (fn j)j)離心離心 (一一)差速離心差速離心（differential centrifugation）方法：從高速到低速逐級(jí)沉降。方法

47、：從高速到低速逐級(jí)沉降。分離分離(fnl)對(duì)象：體積、質(zhì)量差別對(duì)象：體積、質(zhì)量差別較大較大 的顆粒的顆粒 。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第72頁/共166頁第七十三頁，共166頁。(二二)速度沉降（速度沉降（velocity sedimentation）方法：在離心管中制備由頂部到底部逐漸增加方法：在離心管中制備由頂部到底部逐漸增加 的蔗糖的蔗糖(zhtng)溶液密度梯度溶液密度梯度(通常通常5%20%)。分離對(duì)象：沉降系數(shù)不同的顆粒。分離對(duì)象：沉降系數(shù)不同的顆粒。 退退 出出T

48、echnology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分的分級(jí)(fn (fn j)j)離心離心 第73頁/共166頁第七十四頁，共166頁。(三三)平衡沉降（平衡沉降（equilibrium sedimentation） 方法：在離心管中制備由頂部到底部高濃度差的方法：在離心管中制備由頂部到底部高濃度差的 蔗糖或氯化銫溶液密度梯度。蔗糖或氯化銫溶液密度梯度。 分離分離(fnl)對(duì)象：密度不同顆粒。對(duì)象：密度不同顆粒。退退 出出Technology for Cell Biol

49、ogy首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分二、細(xì)胞器及細(xì)胞組分(zfn)(zfn)的分級(jí)的分級(jí)離心離心 第74頁/共166頁第七十五頁，共166頁。速度速度(sd)沉降沉降(A)和平衡沉降和平衡沉降(B)離心離心的比較的比較 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法二、細(xì)胞二、細(xì)胞(xbo)(xbo)器及細(xì)胞器及細(xì)胞(xbo)(xbo)組組分的分級(jí)離心分的分級(jí)離心 第75頁/共166頁第七十六頁，共166頁。(四四)非細(xì)

50、胞體系非細(xì)胞體系 (cell free system) 1. 概念概念非細(xì)胞體系是指從分級(jí)分離得到的具有生物非細(xì)胞體系是指從分級(jí)分離得到的具有生物(shngw)功能的細(xì)胞抽提物。功能的細(xì)胞抽提物。2. 應(yīng)用應(yīng)用將某個(gè)生物將某個(gè)生物(shngw)過程與細(xì)胞中發(fā)生的其他復(fù)過程與細(xì)胞中發(fā)生的其他復(fù)雜的反應(yīng)分割開來，從而確定其詳細(xì)的分子機(jī)制，雜的反應(yīng)分割開來，從而確定其詳細(xì)的分子機(jī)制，研究各種細(xì)胞器及細(xì)胞成分的功能。研究各種細(xì)胞器及細(xì)胞成分的功能。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法二、細(xì)胞二

51、、細(xì)胞(xbo)(xbo)器及細(xì)胞器及細(xì)胞(xbo)(xbo)組組分的分級(jí)離心分的分級(jí)離心 第76頁/共166頁第七十七頁，共166頁。三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定(一一)柱層析（柱層析（column chromatography） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法第77頁/共166頁第七十八頁，共166頁。1.離子交換層析離子交換層析 填充基質(zhì)：離子交換樹脂。填充基質(zhì)：離子交換樹脂。 分離原理：電荷不同分離原理：電荷不同(b tn)。2.凝膠過濾層析凝膠過

52、濾層析 填充基質(zhì)：多孔性凝膠顆粒。填充基質(zhì)：多孔性凝膠顆粒。 分離原理：大小不同分離原理：大小不同(b tn)。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定(一一)柱層析（柱層析（column chromatography） 第78頁/共166頁第七十九頁，共166頁。3.疏水性層析疏水性層析 填充基質(zhì)：帶有疏水性基團(tuán)的顆粒。填充基質(zhì)：帶有疏水性基團(tuán)的顆粒。 分離原理：疏水性不同。分離原理：疏水性不同。4.親和層析親和層析 填充基質(zhì)：結(jié)合填充

53、基質(zhì)：結(jié)合(jih)有酶底物、特異性抗體或抗有酶底物、特異性抗體或抗原的顆粒。原的顆粒。 分離原理：親和性不同。分離原理：親和性不同。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定(一一)柱層析（柱層析（column chromatography） 第79頁/共166頁第八十頁，共166頁。 三種三種(sn zhn)(sn zhn)層析用的基質(zhì)層析用的基質(zhì) 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章

54、細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第80頁/共166頁第八十一頁，共166頁。(二二)高效高效(o xio)液相層析（液相層析（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）填充基質(zhì)：填充基質(zhì)：310 m的微小球型樹脂。的微小球型樹脂。 特點(diǎn)：分離特點(diǎn)：分離(fnl)速度快、分離速度快、分離(fnl)度高。度高。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定第81頁/共166頁第八十二

55、頁，共166頁。( (二二) )高效高效(o xio)(o xio)液相層析液相層析高效液相分子篩色譜測(cè)定高效液相分子篩色譜測(cè)定(cdng)純化蛋白的純化蛋白的分子量分子量退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定第82頁/共166頁第八十三頁，共166頁。( (三三) ) 蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳(din (din yn)yn)蛋白質(zhì)帶有凈電荷，具有不同形狀蛋白質(zhì)帶有凈電荷，具有不同形狀(xngzhun)、大小以、大小以及凈電荷的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中會(huì)產(chǎn)

56、生不同的遷移速率，及凈電荷的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中會(huì)產(chǎn)生不同的遷移速率，進(jìn)而被分離。進(jìn)而被分離。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定第83頁/共166頁第八十四頁，共166頁。(三三) 蛋白質(zhì)電泳蛋白質(zhì)電泳(din yn)1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS polyacrylamid gel electrophoresis ， SDS-PAGE）支持支持(zhch)體：聚丙烯酰胺。體：聚丙烯酰胺。樣品處理：樣品處理： SDS還

57、原劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇還原劑：巰基乙醇、二硫蘇糖醇 分離原理：依據(jù)分子量的不同分離蛋白質(zhì)。分離原理：依據(jù)分子量的不同分離蛋白質(zhì)。 所有蛋白質(zhì)帶有所有蛋白質(zhì)帶有負(fù)電荷，呈伸展負(fù)電荷，呈伸展的多肽鏈的多肽鏈 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定三、蛋白質(zhì)的分離與鑒定第84頁/共166頁第八十五頁，共166頁。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE） 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)

58、胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法第85頁/共166頁第八十六頁，共166頁。2.等電聚焦（等電聚焦（isoelectric focusing）電泳）電泳 支持體：丙烯酰胺凝膠。支持體：丙烯酰胺凝膠。條件：兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)當(dāng)中形成條件：兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)當(dāng)中形成pH梯度梯度(t d)。分離原理：依據(jù)等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)。分離原理：依據(jù)等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)。 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定第86頁/共166頁

59、第八十七頁，共166頁。2.等電聚焦等電聚焦(jjio)（isoelectric focusing）電泳）電泳 退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究細(xì)胞生物學(xué)研究(ynji)(ynji)方法方法三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定第87頁/共166頁第八十八頁，共166頁。3.雙向電泳雙向電泳 原理：等電聚焦與原理：等電聚焦與SDS-PAGE結(jié)合結(jié)合 。在長(zhǎng)條狀凝膠介質(zhì)中進(jìn)行等電聚焦電泳在長(zhǎng)條狀凝膠介質(zhì)中進(jìn)行等電聚焦電泳 。將凝膠條橫放于聚合好的平板將凝膠條橫放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝膠上丙烯酰胺凝膠上

60、進(jìn)行垂直電泳進(jìn)行垂直電泳 。應(yīng)用：可一次分離應(yīng)用：可一次分離(fnl)數(shù)千種蛋白。數(shù)千種蛋白。退退 出出Technology for Cell Biology首首 頁頁第三章第三章 細(xì)胞細(xì)胞(xbo)(xbo)生物學(xué)研究方法生物學(xué)研究方法三、蛋白質(zhì)的分離三、蛋白質(zhì)的分離(fnl)與鑒定與鑒定第88頁/共166頁第八十九頁，共166頁。四、核酸的分離純化四、核酸的分離純化(chn hu)(chn hu)與鑒定與鑒定( (一一) )差速離心沉淀是核酸分離純化的主要差速離心沉淀是核酸分離純化的主要(zhyo)(zhyo)方法方法 DNA還是還是RNA，它們?cè)诩?xì)胞中總是與蛋白，它們?cè)诩?xì)胞中總是與蛋白