核酸提取純化常見問題解答

1、核酸提取純化常見問題解答1. AccuPrep ?凝膠回收試劑盒常見問題2. AccuPrep ?基因組DNA提取試劑盒常見問題3. AccuPrep ? GMO提取試劑盒常見問題4. AccuPrep ? PCR純化試劑盒常見問題5. AccuPrep ?質粒提取試劑盒常見問題6. AccuPrep ?糞便DNA提取試劑盒常見問題7. AccuPrep ?病毒RNA提取試劑盒常見問題8. 瓊脂糖凝膠回收和 PCR純化常見問題9. 質粒DNA提取操作常見問題AccuPrep ?凝膠回收試劑盒"TopQ1.產量低A1. 1）凝膠不完全溶化會導致 DNA產量的降低。離液鹽不足不僅會導致凝

2、膠溶化不完全，DNA被包裹不能釋放到溶液中，而且還降低柱子對DNA的親和力，最終導致 DNA產量降低。2）加入等量的無水乙醇到 W緩沖液中了嗎？過濃的W緩沖液會將DNA洗脫，從而導致產量的降低。3）錯誤的洗脫緩沖液會降低產量.洗脫緩沖也不能包含過多的鹽.緩沖液的pH應調至。4） 錯誤的結合條件例如pH過高會導致產量的降低GB緩沖液含有pH指示劑，當顏色為黃色時表示pH在正常范圍內。如果顏色為紅色或橘黃色，表示 pH已經超出了正常的范圍。這時應該加入幾滴醋 酸鈉溶液去調整pH值到正常范圍內。5） 放入了過多的瓊脂糖凝膠塊。如果放入了超過 400mg的瓊脂糖凝膠塊可能會降低DNA結合柱的吸附力，從

3、而導致DNA產量的降低。Q2 瓊脂糖凝膠樣品懸浮在溶液中A2.瓊脂糖凝膠樣品懸浮在溶液中，這可能是因為樣品中含有WB緩沖液。WB緩沖液中的乙醇會導致懸浮，這種情況下離心樣品三次。如果懸浮的狀況依然存在，那么打開蓋子空氣中放置10分鐘揮發(fā)乙醇，再離心一次Q3 提純后的后續(xù)酶反應效率降低A3. 1）樣品中高濃度的鹽抑制了酶的活性。這種情況下，加入W緩沖液到結合柱后放置結合柱 5分鐘，然后再離心。2）樣品中含有殘留的 WB緩沖液，殘留的乙醇會抑制后續(xù)的酶反應，結合柱必須要完全晾干。如 果問題仍然存在，第二次離心后讓結合柱晾干 10分鐘。3） 一起被洗脫的玻璃纖維影響了酶的活性，再離 心1分鐘，轉移上

4、清液到一個新的離心管中。AccuPrep ?基因組盒DNA提1tOPQ1. DNA產量或純度低A1. 1）緩沖液或其他試劑暴露在不合適的條件下，導致了效率降低。確保試劑到貨后存放于室溫（15-25 C），試劑使用后瓶蓋要擰緊，保持其pH值及穩(wěn)定性，避免污 染。凍干試劑溶解后應分裝并于-20 C保存。2）在洗滌緩沖液1和2中沒有加入無水乙醇。加入乙醇后，充分混勻洗滌緩沖液 W1和W2，并且作標記，表明乙醇己加入。3）試劑和樣本沒有充分混勻。每次樣本管中加入試劑后都需要及時混勻。4） 您可能沒有選用適合的試劑來洗脫DNA。洗脫DNA需要堿性條件，使用試劑盒中提供的洗脫緩沖液進行洗脫。5）裂解可能不

5、完全。確保裂解液從混濁變的澄清，表明蛋白質已經降解。根據(jù)組織類型不同需要的裂解時間會有差 異。裂解通常需要1-3小時，為保證其效率，可以使用振蕩水浴的方法（如實驗操作中所述）。 樣品中加入蛋白酶K后要立即混勻。裂解液加入結合柱前將樣品與異丙醇充分混勻。6）從組織中提取的產量低。在進行消化與裂解步驟之前確保組織破碎為小塊（或粉末狀），以下兩步增加了與蛋白酶K一起 孵育的時間：A將組織與蛋白酶K孵育過夜。B.將組織與蛋白酶K孵育34小時，然后加入新鮮的蛋白酶K 30止再孵育1 2小時。7）產物在260nm 處的吸光值（A260）太高 結合柱中的玻璃纖維可能與核酸一同被洗脫下來。這些纖維可以將光散射

6、，造成了較高的吸光值 讀數(shù)。在最后的洗脫階段，太多的離心也可能導致將結合柱中的玻璃纖維洗脫下來，除去玻璃纖 維的方法如下面所述。Q2.提取的DNA不能夠被酶切或酶切完全A2.結合柱中的玻璃纖維可能同核酸一起被洗脫下來。這些纖維會抑制酶切反應。最終洗脫步驟完成后，以最大速度離心1分鐘，可以在管底看到玻璃纖維，把上清液轉移到一個新管中，不吸岀原來管中的玻璃 纖維即可。Q3 .組織樣本中的 DNA降解A3.獲得的組織樣本應立即-20 °冷凍保存，直至開始裂解步驟。使用研缽和研棒在液氮作用下將組織研磨成 粉末，在沒有裂解的組織中可能有核酸酶活性。Q4 血液樣本的提取最終洗脫步驟仍有顏色A4.

7、結合柱可能洗滌不充分，應洗滌結合柱直至流出液體成無色，將200 h洗脫液與200（LGC緩沖液混合，再加入100 hl異丙醇，重復純化步驟。Q5 在某些緩沖液中有白色沉淀（TL或GC緩沖液）A5.經過在低溫下的長期存放，組織裂解緩沖液或結合緩沖液中可能出現(xiàn)白色沉淀。在60°C孵育可使沉淀溶解。沉淀對結果無影響，在較高溫度下溶解沉淀后不會提高產量及純化的核酸質量。?AccuPrepGMO提取試劑盒"TopQ1. DNA產量或純度低A1. 1）試劑盒保存條件不適當。到貨后存于15-25 °Co2）緩沖液或其他試劑暴露在不合適的條件下，導致了效率降低。確保試劑到貨后存放

8、于室溫（1525 °）,試劑使用后瓶蓋要擰緊，保持其 pH值及穩(wěn)定性，避免污 染。凍干試劑溶解后應分裝并于 28 'C或-15-25 'C保存。3）使用前在洗滌緩沖液中沒有加入無水乙醇。加入乙醇后充分混勻并存于1525 C。做標記標明是否已加入。4）試劑和樣本沒有充分混勻。每次樣本管中加入試劑后都需要及時混勻。Q2. DNA 洗脫回收率低A2.可能使用了不適當?shù)南疵摼彌_液。不要用水洗脫，請用試劑盒中提供的洗脫緩沖液洗脫。Q3. 提取的 DNA 不能夠被酶切或酶切完全A3. 結合柱中的玻璃纖維可能同核酸一起被洗脫下來。這些纖維會抑制酶切反應。最終洗脫步驟完成后，以最大速

9、度離心1分鐘，可以在管低看到玻璃纖維，把上清液轉移到一個新管中，不吸出原來管中的玻璃 纖維即可。Q4.產物在260nm 處的吸光值（A260）太高A4. 結合柱中的玻璃纖維可能與核酸一同被洗脫下來。這些纖維可以將光散射，造成了較高的吸光值讀數(shù)。除 去玻璃纖維的方法如上所述。Q5. DNA 產量低A5. 1） 蛋白酶 K 溶解不完全。按照下面步驟完全溶解蛋白酶 K:1. 吸取 2.5ml 雙蒸水加入蛋白酶 K 凍干粉小瓶中。2. 蓋上瓶蓋，顛倒幾次使蛋白酶 K 完全溶解。3分裝并做標記，存于 -5 to -25 Co注意：按照此種方法溶解的蛋白酶K至少可穩(wěn)定存放12個月。2）裂解不完全。加入蛋白

10、酶 K后立即將樣本混勻。裂解液加入結合柱前要與異丙醇徹底混勻。Q6. 從組織中提取產量低A6.蛋白酶K消化不完全。確保消化與裂解步驟之前組織破碎成小塊。有兩種方法增加孵育時間：.組織與蛋白酶K 一起孵育過夜,或孵育蛋白酶K 34小時，再加入30 I蛋白酶K溫育12小時。Q7.組織樣本中的DNA降解A7.在沒有裂解的組織中存在核酸酶活性。組織在進行裂解步驟前應該凍存于-20 C,樣品進行勻質化時使用小塊組織（20-40 mg）。Q8.血液樣本的提取最終洗脫步驟仍有顏色A8.結合柱可能洗滌不充分，應洗滌結合柱直至流出液體成無色，將200 4洗脫液與400 4結合緩沖液混合，再加入100 4異丙醇，

11、重復純化步驟。Q9.在PL緩沖液和B緩沖液中有白色沉淀A9.經過在低溫下的長期存放，PL緩沖液或B緩沖液中可能出現(xiàn)白色沉淀。在70°C孵育可使沉淀溶解沉淀對結果無影響，在較高溫度下溶解沉淀后不會提高產量及純化的核酸質量。AccuPrep盒PCR化試1TOPQ1.低產量A1. 1.您是否將PCR產物與結合緩沖液充分混勻？不足濃度的離液鹽不會增加DNA與結合柱的吸附。2. 您是否在洗滌緩沖液中加入了足量的無水乙醇？濃縮的洗滌緩沖液可以洗去結合的DNA。3. 使用不正確的洗脫緩沖液可能會降低產量。洗脫緩沖液不能含有太多鹽離子，最適pH值應為7.0-8.5Q2.樣品在瓊脂糖凝膠中上樣后漂浮A

12、2 .樣品可能包含殘留的洗滌緩沖液因而導致漂浮。必須離心確保柱子中沒有掛壁的液滴。如果這種情況 持續(xù)發(fā)生，第二次離心后可以將柱子在空氣中晾干10 min，然后再進行洗脫。Q3.后續(xù)酶切反應不正常A3. 1 .樣品中高濃度的鹽離子會抑制酶切反應，這種情況下，應在結合柱中加入洗滌緩沖液后靜置5 min.再離心2樣品中包含殘留的洗滌緩沖液，殘留的乙醇影響酶切反應的進行，結合柱必須完全干燥。如果這種情況持續(xù)發(fā)生，第二次離心后可以將柱子在空氣中晾干10 min，然后再進行洗脫。3. 玻璃纖維與核酸一同被洗脫下來干擾了酶的活性，離心1min將上清轉移至一個新管即可。AccuPrep ?質粒提取試劑盒1T0

13、PQ1.質粒產量低A1. 1 .您是否收集了足夠數(shù)量的細胞？產量依賴于宿主菌型，細胞過量也可能會使產量降低.請參閱附錄。2. 您是否使用了重懸緩沖液充分懸浮細胞？不完全重懸浮細胞會降低裂解效率。3. 中和緩沖液中是否有鹽沉淀？渦旋振蕩重新使沉淀溶解。離液鹽濃度不適當會導致產量的降低。如果沉淀不易溶解，可于 60 C加熱。4加入RNase A干粉后試劑是否保存超過了 6個月？低濃度的RNase A可以導致質粒產量低，6個月后，再加入一些 RNase A，至多達到100 0血Q2.染色體DNA污染（電泳分析時岀現(xiàn)了雜帶 ）A2.在第三步，樣品不能夠渦旋和劇烈振蕩，裂解時間不能超過5分鐘，這些都可能

14、切斷染色體DNA，輕柔處理裂解液。Q3.進行瓊脂糖凝膠電泳上樣時樣品漂浮A3.樣品含有殘留乙醇導致了漂浮，離心后必須使柱子完全干燥，確保結合柱內無掛壁液滴。Q4.序列分析時有許多背景條帶A4.您是否檢查了宿主 E. coli菌株的內切酶活性？HB101, JM 系列及正常野生型宿主有很高內 切酶活性，通過降解質粒干擾測序反應。對于這些類型，需要第七步變性過程。Q5.樣品中含有RNAA5. 1.收集細胞的量過多。我們推薦使用適當?shù)牧?，根?jù)附錄中顯示的宿主細胞光密度。2. RNase活性減弱。RNase A干粉加入到重懸緩沖液中保存超過6個月以上，RNase活性會減弱,需再加入一些 RNase A

15、 干粉，多至100 回 丄。Q6.玻璃纖維的洗脫A6.玻璃纖維與核酸一同被洗脫下來干擾了酶的活性，以最大速度離心1min，上清轉移至一個新管即可。AccuPrep ?糞便DNA提取試劑盒1TOPQ1.提取后DNA純度過低A1. 1 試劑盒的儲存條件不正確。？試劑盒到貨后需要15-25 'C保存.2. 緩沖液和其他試劑暴露在影響其活性的環(huán)境下。？所有緩沖液均應保存于15-25 °。試劑瓶使用后均要蓋好蓋子以保護其pH值和穩(wěn)定性，避免污染。任何凍干的試劑被稀釋使用后都要儲存在2-8 C 或-15- -25 C。3. 洗滌緩沖液（W Buffer）中沒加乙醇。 ？ W Buffer

16、使用之前要先加入適量的無水乙醇。加入后混合好，并儲存于15 - 25 C .做好標記以便區(qū)分是否已加入乙醇。4. 樣品和試劑沒有完全混合。？每一步加完試劑到樣品中后，都要充分混勻。Q2.洗脫后，DNA的回收率低A2.可能沒有用適合的洗脫緩沖液去洗脫DNA.洗脫液需要用堿性的緩沖液。a下次實驗時不要用水洗脫DNA，用試劑盒中的洗脫緩沖液洗脫DNAQ3.提取的DNA用限制性酶切不完全或完全不能進行酶切A3.玻璃纖維可能會同 DNA 一起被從柱子中洗脫，它會影響內切酶的活性，最后的洗脫步驟完成后，離心機調到最大速度離心一分鐘.玻璃纖維可能在管底被觀測到。將上清液轉移到一個新的管中，注意不要帶走管底的

17、玻璃纖維。Q4.用分光光度計定量時 A260值過高A4.玻璃纖維可能同DNA 一起從柱子中洗脫下來，它也有吸光作用導致A26o值過高？除去玻璃纖維的方法同上述方法一樣。Q5. DNA產量過低A5. a.蛋白酶K沒有被完全溶解。按如下的操作步驟完全溶解蛋白酶K:1) .取1.25ml的雙蒸水到盛有蛋白酶 K的管中。2) .蓋上管蓋，顛倒幾次直到蛋白酶 K完全溶解。3) .分裝后儲存于 -5 to -25 °C .*注意：用這種方法儲存得當，蛋白酶 K的活性可以保存1年以上。 b可能裂解不完全。？加入蛋白酶K后立即將樣品混合好。 在樣品加入結合柱之前，一直攪拌將異丙醇和裂解產物混合好。Q

18、6. SL緩沖液或ST緩沖液中出現(xiàn)白色沉淀A6.在長時間的低溫下保存 SL緩沖液或ST緩沖液，其中會出現(xiàn)白色沉淀。 ？任何在SL緩沖液或ST 緩沖液中出現(xiàn)的白色沉淀， 都必須在70。C下加熱溶解.沉淀并不影響緩沖液的功能，高溫溶解沉淀也不會 增加提取核酸的產量。AccuPrep ?病毒RNA提取試劑盒1TOPQ1.提取后的RNA純度低A1. 1 試劑盒的保存溫度不正確，試劑盒需要15-25 C保存。2. 加入Poly(A)到VB緩沖液后混合完全。3. 洗滌緩沖液(W Buffer )中沒加乙醇，W Buffer使用之前要先加入適量的無水乙醇。混合好后儲存于1525 C。做好標記以便區(qū)分。4.

19、樣品和試劑沒有混合完全，每一步試劑加到樣品中后，都要充分混合Q2.洗脫后，RNA的回收率低A2.可能沒有用適合的洗脫緩沖液去洗脫RNA.洗脫液需要用堿性的 PH緩沖液.0下次實驗時不要用水洗脫，請使用用試劑盒中的洗脫緩沖液進行洗脫。瓊脂糖凝膠回收和PCR純化常見問題仃0PQ1.產量低A1. 1）溶解不完全使產量降低。不足濃度的離液鹽影響DNA與硅基質表面的結合。2）您是否在W緩沖液中加入了足量的乙醇？濃縮的W緩沖液可能會洗去結合的 DNA。3）使用不適當?shù)南疵摼彌_液可能降低產量。洗脫緩沖液不應包含太多的鹽。緩沖液pH值應調至7.0-8.5。4）不適當?shù)慕Y合條件如高 pH值會降低產量。SB緩沖液包含pH指示劑，顏色為黃色。超出 pH范圍 后顏色變?yōu)榧t色或橙色。這種情況下可加入醋酸鈉調整pH值至適當范圍。5）切割的膠塊太大，