鼠骨骺增殖區(qū)細(xì)胞的分離鑒定和克隆構(gòu)建PTHrp基因真核表達(dá)載體

1、鼠骨骺增殖區(qū)細(xì)胞的分離鑒定和克隆構(gòu)建PTHrp基因真核表達(dá)載體 作者 黃仕龍陳安民郭風(fēng)勁張衣北【關(guān)鍵詞】 殖區(qū)軟骨細(xì)胞, 摘要：目的分離、鑒定大鼠骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，克隆甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrp）基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPIRES2PTHrp。方法Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，用X型膠原抗體和電鏡鑒定，提取總RNA，RTPCR方法獲得PTHrp基因的全長cDNA，插入pCR21 TA克隆載體中進(jìn)行序列測定，測序正確后將其亞克隆至表達(dá)載體pEGFPIRES2。結(jié)果分離出增殖區(qū)軟骨細(xì)胞，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析和DNA序列測定證實目的基因已插入重

2、組質(zhì)粒。結(jié)論準(zhǔn)確分離增殖區(qū)軟骨細(xì)胞并成功構(gòu)建了PTHrp基因的真核表達(dá)載體，為進(jìn)一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能及其在在軟骨細(xì)胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：PTHrp基因；質(zhì)粒；殖區(qū)軟骨細(xì)胞；表達(dá)載體Identification of epiphyseal proliferating zone cells and construction of eukaryotic expression vector containing PTHrp geneAbstract：ObjectiveTo separates proliferating zone cells from the gr

3、owth plate,then clone the parathroid hormonerelated peptide gene (PTHrp) and construct its eukaryotic expression vectorMethodAfter centrifugation through a discontinuous Percoll gradient,the third and fourth fractions cell populations of growth plate chondrocytes were identified with anticollagen ty

4、pe X and electron microscope imageThe total RNA was extracted from cells after identification and the full length eDNA encoding PTHrp gene was obtained by RTPCR method and inserted into pCR21 TA cloning vectorAfter the sequencing was confirmed,the gene was subcloned to pEGFPIRES2 to construct recomb

5、inant eukaryotic expression vector pEGFPIRES2PTHrpResultThe proliferating zone cells were separated from growth plateEnzyme digestion analysis and sequencing showed that the target gene was cloned into recombinant vectorConclusionThe proliferating zone cells were identified accurately and the eukary

6、otic expression plasmid containing PTHrp gene was successfully constructed,which may be a promising for studying the biological function of the PTHrp gene and its role in chondrocyte differentiation and bone formationKey words：PTHrp gene; Plasmid;Growth chondrocyte; Expression vector 軟骨缺損臨床極為常見。軟骨受損

7、后自我修復(fù)能力極為有限，且對軟骨細(xì)胞的增殖、分化規(guī)律和調(diào)控機(jī)理缺乏認(rèn)識，目前對軟骨缺損尚無很好的治療方法。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PTHrp)在研究惡性腫瘤高鈣血癥時被發(fā)現(xiàn)，故稱為體液惡性腫瘤高鈣血癥因子(HHM)，因與PTH生物學(xué)特性相似，現(xiàn)在稱為PTHrp其基因定位于12號染色體短臂。近年來，對PTHrp的功能研究取得了初步進(jìn)展，但其確切的生物學(xué)作用仍不清楚。PTHrp分布較廣，在骨骺增殖區(qū)細(xì)胞中豐度最高。有研究發(fā)現(xiàn)PTHrp主要通過自分泌和旁分泌發(fā)揮作用，最近研究表明PTHrp是一種重要的發(fā)育調(diào)節(jié)分子，可能通過Ihh信號途徑抑制軟骨細(xì)胞的分化和成熟并刺激其增殖，以延長軟骨發(fā)育成熟過程，延遲

8、軟骨發(fā)育，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，從而有利于骨骼在生長發(fā)育階段形成復(fù)雜的形狀和結(jié)構(gòu)。由此可見，深入研究PTHrp基因的功能對于闡明軟骨骺板分化發(fā)育機(jī)理以及調(diào)節(jié)軟骨生長都有重要意義。本研究從骨骺增殖區(qū)軟骨細(xì)胞中克隆得到了PTHrp基因，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，為下一步揭示PTHrp的生物學(xué)功能以及其在軟骨細(xì)胞的分化和骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法11 主要材料純系清潔級SD大鼠由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。111 主要試劑和工具酶載體pEGFPIRES2購自美國lnvitrogen公司，載體pCR21 TA、菌種Ecoli DH5由同濟(jì)醫(yī)院矯形外科實驗室保存，DMEMF12培

9、養(yǎng)基購自Hyclone公司，胎牛血清、青鏈霉素、collagenaseP、DNA酶I購自Gibco公司，DNALadder、TrizolReagent、BamHI、EcoRl、TaqDNA合成酶，購自MBI Fermentas公司，T4DNA連接酶購自Promega公司，兔抗鼠anticollagentype X購自Calbiochem公司，PCR clean up kit、NDA Extraction Kit、Plasmid lsolation Kit購自上海華舜公司，SP9000免疫組化試劑盒、ZLI9032濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋公司。112 引物設(shè)計根據(jù)GeneBank(NM

10、012636)序列編碼區(qū)自行設(shè)計上下游引物，由上海生工工程公司合成，上游序列為：5CG GAA TTC TGG AGG CGC TGA TTC CTA CA3，下游序列為：5CG GGA TCC AAC GTG TCC TTG GAA GAT CT3。12 方法121 骨骺生長板增殖區(qū)軟骨細(xì)胞的取材參考靳小兵1，Barbara DBoyan等2的方法并做適當(dāng)改良。無菌分離新生SD大鼠股骨和脛骨，去除軟組織，銳性分離骨骺與骨干之間膨大、半透明組織置DMEMF12培養(yǎng)基中，充分剪碎37 孵育過夜。根據(jù)Jurgen Weisser等4方法，組織碎片以01胰蛋白酶(HBSS配制)37 溫和振蕩孵育20

11、 min，DMEMF12洗滌，001膠原酶P 37 溫和振蕩消化過夜，繼以01膠原酶P 37 處理4 h以充分釋放細(xì)胞。40目篩網(wǎng)過濾、洗滌后以含001DNA酶I的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，小心移至預(yù)先配置的不連續(xù)percoll密度梯度液頂層，400 g離心1 h，取第4層細(xì)胞(密度約為1053 gml)觀察(圖1)、計數(shù)后接種于含10FBS、50 gml VitC 的DMEMF12培養(yǎng)基中，5CO2，100濕度，37 培養(yǎng)24 h后換液，以后每72h換液1次，細(xì)胞融合至7580傳代。取傳第4代細(xì)胞鑒定(圖2)3。122 增殖區(qū)軟骨細(xì)胞的鑒定取第4代細(xì)胞，以104ml的密度接種于24孔板，培養(yǎng)35 d，

12、細(xì)胞爬片后按SP試劑盒的方法固定、漂洗、破膜，anticollagen type X孵育，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片后觀察(圖3)。取生長良好的第4代細(xì)胞，常規(guī)方法制備透射電鏡標(biāo)本(圖4)。123 PTHrp基因的克隆取第4代軟骨細(xì)胞約106數(shù)量級，按Trizol Reagent Kit說明書操作，一步法提取增殖區(qū)軟骨細(xì)胞總RNA，測濃度后取約2 g總RNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板，根據(jù)Revertaid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA第1鏈，常規(guī)50 l PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增PTHrp基因開放閱讀區(qū)片斷，模板用量1 l。PCR反應(yīng)條件為：95 預(yù)變性5

13、min，94 變性1 min；62 退火45 s；72 延伸45 s；經(jīng)30個循環(huán)，72 延伸10 min。取5 l反應(yīng)產(chǎn)物，以12瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。124 克隆載體的構(gòu)建和序列測定TA克隆載體pCR21與經(jīng)PCR clean up kit純化的PCR產(chǎn)物按15(摩爾比)的比例在T4DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，22 反應(yīng)1 h。連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ecoli DH5細(xì)菌，將轉(zhuǎn)化的菌液涂在Xgal處理過的Ampr的LB瓊脂糖平板上培養(yǎng)12h，在長出藍(lán)、白克隆的LB平板上挑取白色克隆進(jìn)行少量擴(kuò)增、質(zhì)粒小提，單酶切初步鑒定陽性細(xì)菌克隆，將酶切鑒定正確的細(xì)菌克隆送交上海生工公司測序。

14、125 PTHrp真核表達(dá)載體的構(gòu)建測序正確的質(zhì)粒pCR21PTHrp以限制性核酸內(nèi)切酶BamHI和EcoRI 37 雙酶切2 h。載體pEGFPIRES2同樣以BamHI和EcoRI 37 雙酶切3 h,使之完全線性化。載體和目的片斷均12瓊脂糖凝膠電泳，膠回收后根據(jù)相應(yīng)濃度按載體：目的基因摩爾比為110在T4DNA連接酶作用下22 連接1h，反應(yīng)體系為20 l；連接反應(yīng)液轉(zhuǎn)化感受態(tài)Ecoli DH5菌，涂布于kanr的LB瓊脂糖平板篩選，挑取生長良好的細(xì)菌克隆于LB培養(yǎng)基中振蕩過夜，以High Pure Plasmid Isolation Kit提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒進(jìn)行BamHI和EcoRI

15、雙酶切鑒定，體系同上；酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳并照片。重組質(zhì)粒命名為pEGFPIRES2-PTHrp。1 靳小兵，羅卓荊，楊柳，等.人胚肋軟骨靜止區(qū)細(xì)胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性研究J.中國矯形外科雜志，2004，4(1)：5759.2Boyan BD,Schwartz Z,Swain LD,et al.Differential expression of phenotype by resting zone and growth region costochondral chondrocytes in vitroJ.Bone,1988,9:185194.3Schwartz Z,Ehland H,Sy

16、lvia V.L,et al.1,25dihydroxyvitamin D3 and 24R,25dihydroxyvitamin D3 modulate growth plate chondrocyte physiology via protein kinase Cdependent phosphorylation of extracellular signalregulated kinase1/2 mitogenactivated protein kinaseJ.Endocrinology,2002,143(7):27752786.4 Jurgen W,Silvia R,Martina S

17、.Four distinct chondrocyte populations in the fetal bovine growth plate:highest expression levels of PTH/PTHrp receptor,Indian hedgehog,and MMP13 in hypertrophic chondrocytes and their suppression by PTH (134) and PTHrp(140)J.Exp Cell Res,2002,279(1):113.5 Colin F,David J,Elaine S,et al.Regulation of chondrocy