肺癌組織中蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜分析方法的建立-

1、熱與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)是利用它們的互補(bǔ)作用,在減少化療藥物用量,降低熱療溫度的情況下保持甚至提高療效,作者認(rèn)為紫杉醇具備上述優(yōu)點(diǎn),作為熱化療聯(lián)合應(yīng)用治療口腔頜面部惡性腫瘤的首選化療藥物,有著廣闊的前景。而對(duì)于39低藥物濃度作用時(shí)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞增殖活性明顯增加的現(xiàn)象國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道,其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)1劉寶林,顧曉明主編.口腔頜面外科學(xué).沈陽(yáng):遼寧科技出版社,2000.2802韓銳.腫瘤化學(xué)預(yù)防及藥物治療.北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1991.5193van der Zee J.Heating the patient:a p r om ising app r o

2、ach?Ann Oncol,2002,13(8:11734W ester mann AM,Gr osen E A,Katschinski D M ,et al .A p il otstudy of whole body hy perther m ia and carbop latin in p latinu m 2resistant ovarian cancer .Eur J Cancer,2001,37(9:11115Van Heek 2Romanowski R,Putter S,Trarbach T,et al .Et opo 2side t oxicity on human neur o

3、blast oma cells in vitr o is en 2hanced by p receeding hyperther m ia .Med Pediatr Oncol,2001,36(1:1976Monge OR,Rofstad EK,Kaalhus O.Ther moche motherapy invivo of a C3H mouse ma mmary carcinoma:sinigle fracti on heat and drug treat m ent .Eur J Cancer Clin Oncol,1988,24(10:16617Stein U,Jurchott K,W

4、 alther W ,et al .Hyperther m ia in 2duced nuclear transl ocati on of transcri p ti on fact or Y B 21leads t o enhanced exp ressi on of multidrug resistance 2related ABC trans porters .J B i ol Che m,2001,276(30:285628Pazdur R,Kudelka AP,Kavanagh JJ,et al .The taxoids:pacli 2taxel (taxol and docetax

5、el (taxotere .Cancer Treat Rev,1993,19(4:3519Perez E A,Buck walter CA,Reid JP .Combinati ons of pacli 2taxel and et oposide in the treat m ent of lung cancer .Se m in Oncol,1996,23(6Supp l 15:2110Donehower RC,Rowinsky EK,Gr ochow LB,et al .Phase Itrial of taxol in patients with advanced cancer .Canc

6、er Treat Rep,1987,71(12:117111Jordan MA,T os o RJ,Thr o wer D,et al .Mechanis m of m it oticbl ock and inhibit or of cell p r oliferati on by tax ol at l o w concen 2trati on .Pr oc Natl Acad Sci US A,1993,90(20:955212U rano M ,Kur oda M ,N ishi m ura Y .For the clinical app lica 2ti on of ther moch

7、e motherapy given at m ild te mperatures .I nt J Hyperthe m ia,1999,15(2:7913KappelM ,Stadeager C,Tvede N,et al .Effects of in vivohyperther m ia on natural killer cell activity,in vitr o p r olifera 2tive res ponses and bl ood mononuclear cell subpopulati ons .Clin Exp I m munol,1991,84(1:175(20052

8、03210收稿責(zé)任編輯姜春霞3河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目004022300;211工程重點(diǎn)項(xiàng)目腫瘤與生物子項(xiàng)目肺癌組織中蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜分析方法的建立3張慧珍1范清堂1吳逸明21鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州4500522鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生學(xué)教研室鄭州450052男,59歲,教授,博士生導(dǎo)師,研究方向:腫瘤分子生物學(xué)關(guān)鍵詞雙向電泳;圖譜分析;蛋白質(zhì)組;P DQuest 軟件;肺腫瘤中圖分類號(hào)Q503摘要目的:建立一套雙向凝膠電泳圖像的分析方法,為進(jìn)一步分析和鑒定差異蛋白奠定基礎(chǔ)。方法:提取肺癌組織和癌旁組織中的可溶性總蛋白,進(jìn)行雙向凝膠電泳,電泳圖片由專用掃描儀獲取后,

9、應(yīng)用圖像分析軟件(P DQuest 7.1進(jìn)行蛋白差異點(diǎn)的表達(dá)情況分析。結(jié)果:二維電泳圖片經(jīng)過背景消減、點(diǎn)檢測(cè)、點(diǎn)匹配等一系列分析后,得出了差異點(diǎn)。結(jié)論:P DQuest 7.1軟件可以用來快速有效地對(duì)生物樣品之間蛋白質(zhì)的差異進(jìn)行分析。Analysis method of t w o 2di m ensi onal gel electr ophoresis i m ages614鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版2005年5月第40卷第3期ZHAN G Huizhen1,FAN Q ingtang1,WU Yi m ing21D epart m ent of Environm enta l Health,C

10、ollege of Public Health,Zhengzhou U niversity,Zhengzhou4500522D epart m ent of O ccupational Health and Toxicology,College of Public Health,Zhengzhou U niversity, Zhengzhou450052Key wordst w o2di m ensi onal gel electr ophoresis;i m age analysis;p r oteome;P DQuest s oft w are;lung neop las mAbstrac

11、tA i m:T o establish a t w o2di m ensi onal gel electr ophoresis i m age analysis method f or analyzing the differenti2 ally exp ressed p r oteins.M e tho d s:The whole s oluble p r oteins of tissue of lung cancer and the contr ols were extracted by one step and separated using22di m ensi onal gel e

12、lectr ophoresis.Acquire the i m age and analyze the i m ages using the s oft w are P DQuest7.1.R e su lts:After the backgr ound subtracti on,s pot detecti on and matching,the p r otein s pots which exp ressed differentially were obtained.Co nc l u s i o n:The results of di m ensi onal gel electr oph

13、oresis can be ananlyzed quickly and con2 veniently using P DQuest7.1gel i m age analysis s oft w are.蛋白質(zhì)組學(xué)的核心技術(shù)雙向電泳是目前惟一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時(shí)分離與展示的技術(shù),在蛋白質(zhì)組的研究中發(fā)揮著重要作用1。其基本思路就是將生物樣品中的蛋白質(zhì)按照所需方法提取出來,通過等電聚焦電泳和十二烷基磺酸2聚丙烯酰胺凝膠電泳(S DS2P AGE將樣品的所有蛋白在一塊凝膠上顯現(xiàn)出來,通過圖像獲取技術(shù)獲得圖像2。那么如何有效地對(duì)二維電泳圖像進(jìn)行分析,挖掘有價(jià)值的蛋白質(zhì)信息便成了一個(gè)倍受關(guān)注的問題。作者通

14、過研究肺癌組織和癌旁組織之間蛋白的差異情況,采用P DQuest7.1軟件摸索建立了一套成熟的二維電泳圖像分析方法,為下一步對(duì)感興趣的蛋白差異點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1.1標(biāo)本的收集和蛋白質(zhì)的提取實(shí)驗(yàn)采用的肺癌組織和配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,經(jīng)病理學(xué)鑒定。提取組織總蛋白3,B radford方法檢測(cè)蛋白濃度4,-80保存?zhèn)溆谩?.2固相pH梯度2S D S雙向凝膠電泳使用B I O2 RAD公司的雙向電泳儀。第一相等電聚焦使用的預(yù)制膠條pH310。樣品100g中加入上樣緩沖液,總的vh為80000。第二相S DS2P AGE電泳使用120g/L凝膠。考馬斯亮藍(lán)染色

15、。1.3圖像采集與分析軟件使用GS2800獲取圖像后,用P DQuest7.1軟件對(duì)圖像進(jìn)行剪切、編輯、點(diǎn)檢測(cè)、點(diǎn)匹配。2結(jié)果2.1圖像獲取利用P DQuest軟件內(nèi)部支持的圖像掃描裝置GS2800進(jìn)行圖像的獲取。2.2圖像的調(diào)整和背景的消減利用I m age菜單中的剪切(cr op和旋轉(zhuǎn)(r otate功能匹配不同的凝膠所需要的相同尺寸大小和形狀的圖像。在“Transf or m”命令中通過自動(dòng)或手動(dòng)最大限度地消減背景,以避免這些背景對(duì)二維電泳圖像的分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析的影響。2.3點(diǎn)的檢測(cè)和編輯利用軟件中“Spot”菜單的“Spot Detecti on W izard”中的Faint S

16、pot butt on、S mall Spot butt on、Large Spot butt on命令選擇適當(dāng)?shù)狞c(diǎn),軟件系統(tǒng)自動(dòng)設(shè)置檢測(cè)參數(shù),點(diǎn)擊Spot Detecti on but2 t on后系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)。點(diǎn)檢測(cè)完成后可以直接修改檢測(cè)的結(jié)果,調(diào)整密度值、點(diǎn)的面積和最低峰值等參數(shù)直至檢測(cè)出凝膠上所有感興趣的點(diǎn)。點(diǎn)檢測(cè)時(shí)還可通過設(shè)置參數(shù)消除電泳過程中出現(xiàn)的橫紋和豎紋,使蛋白質(zhì)呈點(diǎn)狀分布。點(diǎn)檢測(cè)后圖像上所有的點(diǎn)的中心都可用十字線表示。點(diǎn)檢測(cè)的參數(shù)保存在系統(tǒng)中,用相同方法電泳、染色、掃描得到的圖像可用相同的參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。點(diǎn)檢測(cè)的同時(shí)可以對(duì)點(diǎn)進(jìn)行編輯,例如刪除一些雜質(zhì)斑點(diǎn)、手工添加一些點(diǎn)

17、、手工合成和分割一些點(diǎn)等等。點(diǎn)檢測(cè)完成后,每個(gè)蛋白點(diǎn)的編號(hào)、峰值、量值和位置都可以顯示出來。凝膠掃描圖像經(jīng)過點(diǎn)檢測(cè)后蛋白點(diǎn)會(huì)變得更加清晰,而且分析系統(tǒng)還會(huì)自動(dòng)從清晰的點(diǎn)中建立三維的高斯點(diǎn)。經(jīng)過過濾、檢測(cè)后,二維圖像就會(huì)有三個(gè)獨(dú)立的圖像:原始掃描圖、過濾圖、高斯圖。2.4點(diǎn)匹配點(diǎn)檢測(cè)完成后,軟件系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)提示進(jìn)行匹配(Match。匹配前首先是選擇要比較的一組膠創(chuàng)建Matchest,并選擇一個(gè)點(diǎn)較多、能代表整個(gè)實(shí)驗(yàn)的,并且膠上的點(diǎn)分布較好、清晰的膠作為標(biāo)準(zhǔn)膠(matchset standard的模板。匹配時(shí)要設(shè)立標(biāo)志點(diǎn)(land mark s pots,P DQuest將landmark s po

18、ts作為參照點(diǎn)去調(diào)整和定位自動(dòng)匹配的膠,用于彌補(bǔ)膠成員之間輕微的不同和變形。標(biāo)志點(diǎn)應(yīng)該選擇分辨良好且所有成員膠上均出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn),并盡量避開蛋白質(zhì)聚集的地方,最好在不同的放大倍數(shù)下714Journal of Zhengzhou University(M edical SciencesM ay.2005Vol.40No.3確定該蛋白質(zhì)斑點(diǎn)為所有成員膠上的同一個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。設(shè)立兩個(gè)以上蛋白質(zhì)標(biāo)志點(diǎn)后,便可進(jìn)行不同凝膠上蛋白質(zhì)斑點(diǎn)之間的匹配了,在標(biāo)準(zhǔn)膠中的字母表示這些點(diǎn)在其它膠中已被匹配到。P DQuest 軟件還可以用手工方式編輯誤配的或?qū)]有匹配到的點(diǎn)進(jìn)行手工匹配。肺癌與癌旁組織可溶性蛋白雙向

19、電泳匹配結(jié)果見圖1 。圖1肺癌與癌旁組織可溶性蛋白雙向電泳匹配結(jié)果A:癌旁組織;B:肺癌組織2.5數(shù)據(jù)分析在比較雙向凝膠圖譜時(shí),經(jīng)常有一些由于樣品處理、染色、成像的不同而引起的差異,這些變化不是由蛋白表達(dá)引起的。因此要準(zhǔn)確定量比較,就必須通過歸一化(Nor malizati on 來彌補(bǔ)這些非表達(dá)性的誤差。P DQuest 有幾種歸一化的方法,其中最有效的方法是確定膠之間保守的蛋白,即這些蛋白在所有的膠中都存在且數(shù)量變化不大。在P DQuest 中用Analysis Sets 工具可創(chuàng)建多個(gè)Analysis Sets 系統(tǒng),作者利用Analysis Sets 系統(tǒng),比較分析肺癌和癌旁膠之間變化量超過五倍的蛋白質(zhì)點(diǎn),符合條件的點(diǎn)在膠上標(biāo)出(圖2 。圖2肺癌與癌旁蛋白表達(dá)量差異分析A:肺癌高5倍表達(dá)的蛋白點(diǎn);B:肺癌低5倍表達(dá)的蛋白點(diǎn)2.6結(jié)果輸出完成分析工作后,可以根據(jù)自己的需要將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以圖像、表格、圖表、數(shù)字或文字的形式輸出。3討論3.1實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性與數(shù)據(jù)的可靠性重復(fù)性和可靠性是雙向電泳技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常由上樣、染色等人為因素引起一些非蛋白表達(dá)的差異,直接影響到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可比性。為了更準(zhǔn)確地對(duì)不同凝膠上的蛋白點(diǎn)進(jìn)行分析和比較,P DQuest 軟件的歸一化功能可彌補(bǔ)這些非表達(dá)性的誤差,讓細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平一致