霍亂弧菌新類型溶源性噬菌體基因組結(jié)構(gòu)研究

1、霍亂弧菌新類型溶源性噬菌體基因組結(jié)構(gòu)研究         07-08-11 11:49:00     編輯：studa20                作者：芮勇宇，闞飆，高守一，劉延清，祁國(guó)明 【關(guān)鍵詞】  霍亂弧菌；噬菌體；序列分析,摘要：目的   研究霍亂弧菌埃爾托型（EVC）新類型溶源性噬

2、菌體（CTX）和核心區(qū)不含ctxAB基因的溶源性噬菌體（nct-CTX）基因組的結(jié)構(gòu)。方法   采用基因擴(kuò)增、測(cè)序及序列生物信息學(xué)等方法進(jìn)行觀察與分析。結(jié)果   在我國(guó)EVC中，存在僅攜帶古典型（class）nct-CTX、CTX或埃爾托型（ET）CTX基因組類型，并發(fā)現(xiàn)nct-CTXclass和CTXET共存、nct-CTXnewET和CTXclass共存的新類型。CTX和nct-CTX基因組zot基因3末端，60bp序列中40%位點(diǎn)不同，推測(cè)的氨基酸序列中60%位點(diǎn)不同。class、ET和newET類型ig1、rstR和ig2基因序列同源性分別為77

3、0%974%，104%179%，96%648%，RstR同源性92%241%。CTX基因組均位于染色體TLC基因簇附近。上述不同類型EVC的tcpA、TcpA、ctxA、ctxB、CtxA和CtxB與GenBank中EVC和O139群產(chǎn)毒株的同源性分別>99%，99%，99%，98%，98%和96%。結(jié)論   首次在EVC中發(fā)現(xiàn)nct-CTXclass和CTXET、nct-CTXnewET和CTXclass共存的新類型。關(guān)鍵詞：霍亂弧菌；噬菌體；序列分析 Study on structures of new types of CTX and nct-CTX genom

4、es   Abstract：Objective   To study on structures of new types of CTX and nct-CTX genomes of EI Tor biotype vibrio cholerae.Methods   PCR,sequencing and sequence analysis were conducted.Results   Only nct-CTXclass,CTXclass,or CTXET genome type,nct-CTXclass and

5、CTXET,nct-CTXnewET and CTXclass genomes coexisted types in EI Tor strains isolated from China were found.Different rates of last 60 bp of zot gene and Zot of CTX and nct-CTX were 40% and 60%.Identities of ig1,rstR,ig2 gene and RstR of class、ET and newET types were 77.0%97.4%,10.4%17.9%,9.6%64.8%,and

6、 9.2%24.1% differentially.Different types of CTX genome were found near TLC cluster.Identities of tcpA,TcpA,ctxA,ctxB,CtxA,and CtxB of strains in this study with others toxic EVC and O139 VC were over 99%,99%,99%,98%,98%,and 96%.Conclusion   nct-CTXclass and CTXET,nct-CTXnewET and CTXclass

7、 genomes coexisted types in EI Tor were found first.Key words：vibrio cholerae;phage ;sequence analysis      霍亂弧菌(VC)的溶源性噬菌體（CTX）與新類型霍亂病原菌的產(chǎn)生密切相關(guān)，CTX基因組包括RS區(qū)和核心區(qū)。RS區(qū)依次包括ig1間隔區(qū)、rstR、ig2間隔區(qū)、rstA、rstB和rstC基因。其中主要變異基因?yàn)橐种谱踊颍╮stR）及ig2，國(guó)外已報(bào)道了3種類型，分別發(fā)現(xiàn)于O1群霍亂弧菌古典生物型（CVC）、埃爾托生物型（EVC）和

8、O139群VC，GenBank序列號(hào)分別為VCU83796、AF055890、AF110029，本文暫時(shí)命名為古典型（class）、埃爾托型（ET）和加爾各答型（calc）1- 5。核心區(qū)依次包括cep、orfU、ace、zot和ctxAB基因，核心區(qū)不攜帶ctxAB基因的CTX稱為nct-CTX。本課題在研究我國(guó)EVC的CTX和nct-CTX基因組分布特征時(shí)，發(fā)現(xiàn)1種新類型rstR-ig2基因，暫命名為newET類型，還發(fā)現(xiàn)不同類型rstR-ig2基因的CTX和nct-CTX基因組共存的新類型?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。1   材料與方法11   材料

9、0;  111   菌株   霍亂弧菌EVC（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心），其中攜帶rstR-ig2基因的類型及菌株數(shù)分別為class 10株，ET 10株，class 和ET共存10株，class和newET共存4株。對(duì)共存類型利用ctxAB和zot基因探針Southern雜交，zot基因的拷貝數(shù)均多于ctxAB，表明這些菌株同時(shí)攜帶不同rstR-ig2類型的CTX和nct-CTX基因組。112   主要試劑和儀器   Taq DNA 聚合酶、dNTP、限制性核酸內(nèi)切酶（中國(guó)華美生物工程公司）；Gene Am

10、p PCR system 9600型PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)PE公司）；GDS7500型凝膠成像儀(英國(guó)UVP公司)。12   方法   121   引物設(shè)計(jì)   利用Oligo60軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物在上海生工公司合成。擴(kuò)增片斷分別為：（1）上游引物CTRS上5-ATT GAC AGG ATG AAG GAT ACC-3，下游引物rstA下5-CGG AAT TCT CGA CAT CAA ATG GCA TG -3，用于擴(kuò)增CTX基因組串聯(lián)體的第1個(gè)基因組末端和第2個(gè)起始端之間的基因，擴(kuò)增片斷簡(jiǎn)稱為CR，約1500

11、bp，片段包括ctxB 3端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5端部分基因。（2）上游引物ZCT上5- GCT ACA AGG TGC TAC CGT TAC -3，和引物rstA下配對(duì)，用于擴(kuò)增nct-CTX基因組串聯(lián)體的第一個(gè)基因組末端和第2個(gè)起始端之間的基因，擴(kuò)增片斷簡(jiǎn)稱為ZR，約1500bp，包括zot 3端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5端部分基因。對(duì)CR和ZR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，內(nèi)切酶選用RsaI和BglII。（3）上游引物TLC上5-CTT GGA TTA AGT CAA CCA GAG -3，和引物rstA下配對(duì)，擴(kuò)增片斷簡(jiǎn)稱為TR，約20kb，包括T

12、LC基因簇3端部分基因、ig1、rstR、ig2和rstA5端部分基因。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，內(nèi)切酶選用RsaI和BglII。（4）ctxAB基因分段擴(kuò)增：利用ZCT上和ZCT下5- GTG TGT TGT GGT ATT CTG CAC -3，引物CTB上5- GGT GTA AAA TTC CTT GAC G -3和CTB下5- GCT TCT CAT CAT CGA ACC -3擴(kuò)增，擴(kuò)增片段分別約1000和550bp。（5）tcpA基因擴(kuò)增：引物tcpA上為5- AGA ACA CGA TAA GAA AAC CG -3和tcpA下5- AAC GCT GGA TTT GAG ATG

13、 AC -3，擴(kuò)增片段約900bp。122   PCR擴(kuò)增及酶切   PCR反應(yīng)體積50l，1×PCR緩沖液，100mol dNTP，05mol引物，10 U Taq DNA聚合酶，模板約100ng（采用SDS裂解-酚氯仿抽提-乙醇沉淀方法制備）。PCR擴(kuò)增的循環(huán)參數(shù)為：94 5min；94 15s，60 15s，72 30s2min，30個(gè)循環(huán)；72 5min。擴(kuò)增產(chǎn)物在10%的瓊脂糖凝膠上（含05g/ml 溴乙錠）電泳，長(zhǎng)波紫外線下觀察并將PCR產(chǎn)物條帶割下，利用試劑盒回收凝膠中PCR產(chǎn)物，回收的PCR產(chǎn)物直接作為測(cè)序模板。直接對(duì)PCR產(chǎn)物

14、進(jìn)行酶切，按內(nèi)切酶試劑盒說(shuō)明書操作，酶切產(chǎn)物同上電泳，紫外燈下觀察并拍照。123   PCR產(chǎn)物測(cè)序及序列分析   提供PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和擴(kuò)增用引物作為測(cè)序引物，由上海博亞公司測(cè)序，對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序。序列拼接及生物信息學(xué)分析應(yīng)用DNAStar軟件分析，網(wǎng)上同源比較應(yīng)用http:/wwwncbinlmnihgov網(wǎng)站BLASTn序列分析軟件。2   結(jié)果21   CR和ZR基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切及測(cè)序結(jié)果（圖1，圖2）   圖1可見(jiàn)，擴(kuò)增雙拷貝nct-CTX基因組的ZR產(chǎn)物經(jīng)酶切分析共分為2種類型，經(jīng)

15、測(cè)序表明rstR-ig2分別為class和newET類型，測(cè)序菌株分別為86015株和JX94484株。擴(kuò)增雙拷貝CTX基因組的CR產(chǎn)物經(jīng)酶切分析共分為2種類型，經(jīng)測(cè)序表明rstR-ig2分別為ET和class類型，測(cè)序菌株分別為S2株和S73株。1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73圖1   ZR和CR的PCR產(chǎn)物RsaI酶切圖譜（略）1：DL2000 DNA Marker；2：ZR86015；3：JX94484；4：CRS2；5：CRS73圖2   ZR和CR的PCR產(chǎn)物BglII酶切圖譜（略）