柱 層 析 簡 介

1、柱柱 層層 析析 簡簡 介介李 正 邦2007-10.17目 錄v 層析的基本原理層析的基本原理層析的基本原理層析的基本概念層析的分類v 柱層析的基本操作柱層析的基本操作原理幾個基本概念基本操作步驟 硅膠柱、大孔吸附樹脂柱、聚酰胺柱v 柱層析常見問題與對策柱層析常見問題與對策吸附劑的選擇洗脫劑的選擇操作方式一、層析的原理一、層析的原理( (一一) ) 層析的基本原理層析的基本原理 層析法（chromatography）又稱色譜法，是利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中

2、的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。（二）（二） 層析的基本概念層析的基本概念v固定相固定相：固定相是層析的一個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。v流動相流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。v系數(shù)系數(shù)K： 是物質(zhì)在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質(zhì)間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同，可視為

3、吸附平衡常數(shù)，分配常數(shù)或離子交換常數(shù)等。（三）（三） 層析的分類層析的分類1、按操作形式、按操作形式：柱層析柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離；紙層析紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的；薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定；2、根據(jù)移動相種類的不同、根據(jù)移動相種類的不同： 氣固層析(GSC) 液液層析(LLC) 氣相層析 液相層析 氣液層析(GLC) 液固層析(LSC)3、按層析的機理：、按層析的機理：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的； 分配層析：利用不同組分在

4、流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離； 離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同；凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。 以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬于一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。 二、柱層析的基本操作 柱色譜一般有吸附色譜和分配色譜兩種。前者常用氧化鋁和硅膠作固定相，在分配柱色譜中以硅膠、硅藻土和纖維素作為支持劑，以吸收一定量的液體作固定相，而支持劑本身不起分離作用。實驗室中最常用的是吸附色譜。根據(jù)混合物中各組分對吸附劑（即固定相）的吸附能力，以及對洗脫劑（即流動相）的溶解度不同將各組分分離。（一

5、）（一） 原理原理層析柱分離物質(zhì)的示意圖層析柱分離物質(zhì)的示意圖 固定相為固體顆粒，裝在層析柱內(nèi)，高5cm，固定相周圍充滿液體流動相，每厘米柱中液相體積為1cm3。若在柱頂加入1cm3溶劑,其中含32mg樣品，同時應有相同體積的溶劑從柱底流出，此時樣品處于柱中A位置。若樣品的分配系數(shù)是1，則它在固相與液相間等量分配。若再有1cm3的溶劑加到柱上，A部分中的溶劑帶著16mg的物質(zhì)向下移動到B，A和B中的物質(zhì)都將發(fā)生再分配A ABCDE321616 8 16 8 4 4 12 12 2 2 8 12 8不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時不同物質(zhì)分配系數(shù)不同時不同組分的含量不同組分的含量 不同組分在柱中的位置不同

6、組分在柱中的位置 上部上部 中部中部 下部下部( (二二) ) 幾個基本概念幾個基本概念 如上圖有：VtVoViVg， 由于Vg相對很小，可以忽略不計，則有：VtVoVi。外水體積外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動相的體積。內(nèi)水體積內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|(zhì)體積基質(zhì)體積是指凝膠顆粒實際骨架體積。而柱床體積柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。（三）基本操作步驟（三）基本操作步驟 裝柱加樣洗脫和分離收集各組分鑒定與檢測1 1、裝柱、裝柱 色譜柱的大小規(guī)格

7、由待分離樣品的量和吸附難易程度來決定。一般柱管的直徑為0.5-10cm，長度為直徑的10-40倍。填充吸附劑的量約為樣品重量的20-50 倍，柱體高度應占柱管高度的3/4。柱子過于細長或過于粗短都不好。裝柱前，柱子應干凈、干燥，并垂直固定在鐵架臺上。將少量洗脫劑注入柱內(nèi)，取一小團玻璃毛或脫脂棉用溶劑潤濕后塞入管中，用一長玻璃棒輕輕送到底部，適當搗壓趕出棉團中的氣泡，但不能壓得太緊，以免阻礙溶劑暢流（如管子帶有篩板，則可省略該步操作）。再在上面加入一層約0.5cm 厚的潔凈細砂，輕扣擊柱管，使砂面平整。 常用的裝柱方法有干裝法和濕裝法兩種（1）干裝法 在柱內(nèi)裝入2/3 溶劑，在管口上放一漏斗，打

8、開活塞讓溶劑慢慢地滴入錐形瓶中，接著把干吸附劑經(jīng)漏斗以細流狀傾瀉到管柱內(nèi)，同時用套在玻璃棒（或鉛筆等）上的橡皮塞輕輕敲擊管柱，使吸附劑均勻地向下沉降到底部。填充完畢后，用滴管吸取少量溶劑把粘附在管壁上的吸附劑顆粒沖入柱內(nèi)，繼續(xù)敲擊管子直到柱體不再下沉為止。柱面上再加蓋一薄層潔凈細砂，把柱面上液層高度降0.11cm，再把收集的溶劑反復循環(huán)通過柱體幾次，便可得到沉降得較緊密的柱體。（2）濕裝法 基本方法與干裝法類似，所不同的是，裝柱前吸附劑需要預先用溶劑調(diào)成淤漿狀，在倒入淤漿時，應盡可能連續(xù)均勻地一次完成。如果柱子較大，應事先將吸附劑泡在一定量的溶劑中，并充分攪拌后過夜（排除氣泡），然后再裝。其優(yōu)

9、點是一般柱子裝的比較結(jié)實，沒有氣泡。 無論是干裝法，還是濕裝法，裝好的色譜柱應是充填均勻，松緊適宜一致，沒有氣泡和裂縫，否則會造成洗脫劑流動不規(guī)則而形成“溝流”，引起色譜帶變形，影響分離效果。2 2加樣加樣 上樣也有干法和濕法之分：干法就是把待分離的樣品用少量溶劑溶解后，在加入少量硅膠，拌勻后再旋去溶劑。如此得到的粉末再小心加到柱子的頂層。干法上樣較麻煩，但可以保證樣品層很平整。濕法上樣就是用少量溶劑（最好就是展開劑，如果展開劑的溶解度不好，則可以用一極性較大的溶劑，但必須少量）將樣品溶解后，再用膠頭滴管轉(zhuǎn)移得到的溶液，沿著層析柱內(nèi)壁均勻加入。加完后，用少量溶劑把容器和滴管沖洗凈并全部加到柱內(nèi)

10、，再用溶劑把粘附在管壁上的樣品溶液淋洗下去。慢慢打開活塞，調(diào)整液面和柱面相平為止，關好活塞。如果樣品是液體，可直接加樣。3 3洗脫與檢測洗脫與檢測 在洗脫過程中，柱內(nèi)不斷地發(fā)生解吸、吸附，再解吸、再吸附的過程。 當我們選定好洗脫液后，洗脫的方式可分為簡單洗脫、分步洗脫和梯度洗脫三種。 簡單洗脫簡單洗脫：柱子始終用同樣的一種溶劑洗脫，直到層析分離過程結(jié)束為止。如果被分離物質(zhì)對固定相的親合力差異不大，其區(qū)帶的洗脫時間間隔（或洗脫體積間隔）也不長，采用這種方法是適宜的。但選擇的溶劑必須很合適方能使各組分的分配系數(shù)較大。否則應采用下面的方法。 分步洗脫分步洗脫：這種方法按照遞增洗脫能力順序排列的幾種洗

11、脫液，進行逐級洗脫。它主要對混合物組成簡單、各組分性質(zhì)差異較大或需快速分離時適用。每次用一種洗脫液將其中一種組分快速洗脫下來。 梯度洗脫梯度洗脫：當混合物中組分復雜且性質(zhì)差異較小時，一般采用梯度洗脫。它的洗脫能力是逐步連續(xù)增加的，梯度可以指濃度、極性、離子強度或pH值等。最常用的是濃度梯度。 對洗脫液接收時，有色物質(zhì)，按色帶進行收集，但色帶之間兩組分會有重疊。對無色物質(zhì)的接收，一般采用分等份連續(xù)收集，每份流出液的體積毫升數(shù)等于吸附劑的克數(shù)。若洗脫劑的極性較強，或者各成分結(jié)構(gòu)很相似時，每份收集量就要少一些，具體數(shù)額的確定，要通過薄層色譜檢測，視分離情況而定?，F(xiàn)在，多數(shù)用分步接收器自動控制接收。

12、洗脫完畢，采用薄層色譜法對各收集液進行鑒定，或紫外光檢測，以洗脫液體積對被洗脫物質(zhì)濃度作圖，可得到洗脫曲線把含相同組分的收集液合并，除去溶劑，便得到各組分的較純樣品。（四）（四） 硅膠柱、大孔吸附樹脂柱、聚酰胺柱硅膠柱、大孔吸附樹脂柱、聚酰胺柱1 1、硅膠柱、硅膠柱 . . 裝柱裝柱 活化硅膠：活化硅膠：100100110110O OC,0.5hC,0.5h； 層析主經(jīng)長比：層析主經(jīng)長比：1 1：20203030； 樣品與吸附劑比例：樣品與吸附劑比例：1 1：30306060； 沉降平衡。沉降平衡。 .上樣上樣 干法：樣品難溶于洗脫劑時，用少量適當溶劑拌適量硅膠溶解、揮干，上干法：樣品難溶于洗

13、脫劑時，用少量適當溶劑拌適量硅膠溶解、揮干，上柱；柱； 濕法：樣品溶于洗脫劑時濕法：樣品溶于洗脫劑時。 .洗脫：洗脫：溶劑選擇見下（洗脫劑的選擇）溶劑選擇見下（洗脫劑的選擇） .常壓與加壓：常壓與加壓：硅膠粒度細時，為了保證洗脫速度可以適當加壓。硅膠粒度細時，為了保證洗脫速度可以適當加壓。2.2.大孔吸附樹脂柱大孔吸附樹脂柱 大孔吸附樹脂是一種具有大空結(jié)構(gòu)的有機高分子共聚體，是一類人工合成的有機高聚物吸附劑，因其具有多孔性結(jié)構(gòu)而具有篩選性，又通過表面吸附、表面電性或形成氫鍵而具有吸附性。 一般粒度2060目，分為非極性、中級性、極性、強極性。采用大孔吸附樹脂分離純化中藥的有效成分，應根據(jù)欲處理

14、成分的理化性質(zhì)考慮以下因素：適合的樹脂、樹脂預處理、吸附溶質(zhì)的濃度、吸附流速與溫度、解吸附劑種類、解吸附時流速與溫度等。.樹脂前處理樹脂前處理 新購樹脂中可能含有未聚合的單體、分散劑、致孔劑、引發(fā)劑、惰性溶劑等化學殘留，所以使用前必須進行預處理以保證最后藥用安全。一般方法：乙醇浸泡24h，連續(xù)加熱回流數(shù)次(更換新溶劑)后濕法上柱，用乙醇洗脫至流出液與水(1:2)混合不產(chǎn)生渾濁，再用水沖至無醇味，水浸泡備用。注意不同型號樹脂處理方法不同，請按照廠商提供方法處理。.裝柱與上樣裝柱與上樣 方法同前，亦有干法濕法。上樣液最好澄清，故上樣前影進行一定的處理，如預先沉淀、濾過處理、PH處理、使部分雜質(zhì)在處

15、理過程中除去，以免堵塞樹脂床或在洗脫時混入洗脫液中。 .洗脫洗脫 化合物經(jīng)樹脂吸附之后，在樹脂表面或內(nèi)部還殘留許多非極性或水溶性較大的強極性雜志成分，一般用水洗去。為避免損失影同步檢測，然后再用解吸附劑洗脫。注意若解吸附劑中有機部分濃度較高，應采用梯度洗脫，逐步增大濃度，否則，樹脂床中易產(chǎn)生大量氣泡而影響洗脫。注：注： .解析條件的確定要考慮解析條件的確定要考慮：解析劑(解吸附曲線，尖銳不拖尾)；解析劑的PH；解析速度(脫附曲線，流速慢，脫附效果好，但周期長)；解析溫度(一般升溫有利于脫附，但可能使雜質(zhì)混入洗脫液)。 .影響上樣吸附的因素影響上樣吸附的因素 層析主選用不當(:L)；裝柱不當(送

16、進均勻、頂端平整)；藥液處理不當(前處理、反洗、黏性)；上樣流速控制不當(快-吸附不完全，慢-效率低)；樹脂型號選用不當(動態(tài)吸附、靜態(tài)吸附)。3. 3. 聚酰胺柱聚酰胺柱v 聚酰胺是通過酰胺鍵聚合的一類高分子化合物，對堿較穩(wěn)定而對酸不穩(wěn)定，其酰胺鍵可以與酚類、酸類、醌類和硝基化合物等形成氫鍵而被吸附，從而與不能形成氫鍵的化合物分離。聚酰胺具有”雙重色譜”的性能：正向和反向分配色譜。常用于分離酚類、黃酮類、醌類以及脫鞣處理等。v 聚酰胺使用前必須預處理：過篩，再以90-95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3-4BV的90-95%乙醇洗脫，洗至洗脫液透明并在蒸干后無殘渣(或極少殘渣)

17、。再依次用2-2.5BV的5%NaOH水溶液、1BV的蒸餾水、2-2.5BV的10%醋酸水溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH中性，備用。v 裝柱加樣：同大空樹脂。上樣量約1.52.5g/100ml，上樣藥液濃度20%30%v 洗脫：先用水洗，再用醇洗，醇濃度遞增，直至無水乙醇或甲醇，若仍有物質(zhì)未被洗脫，可以用稀氨水或甲酰胺洗脫，分段收集。三、柱層析常見問題與對策三、柱層析常見問題與對策 柱層析成敗的關鍵是選擇合適的吸附劑、洗脫劑和操作方式。( (一一) ) 吸附劑的選擇吸附劑的選擇v 一般要求吸附劑具備以下條件：表面積大、顆粒均勻、吸附選擇性好、穩(wěn)定性強和成本低廉等性能。v 目前常用的吸附劑吸附

18、極性化合物能力的順序為：紙纖維素淀粉糖類硅酸鎂硫酸鈣硅酸硅膠氧化鎂氧化鋁活性炭。 v 在選擇具體吸附劑時，主要是根據(jù)吸附劑本身和被吸附物質(zhì)的理化性質(zhì)進行的。一般來說， 極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì)，非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但是為了便于解吸附，對于極性大的分離物，應選擇極性小的吸附劑，反之亦然。理想的吸附劑必需經(jīng)過多次試驗才能獲得。 1. 硅膠硅膠 最常用的吸附劑,通常用SiO2.xH2O表示,是具有硅氧交聯(lián)結(jié)構(gòu),表面有許多硅醇基的多孔性微粒.硅醇基可與極性化合物或不飽和化合物形成氫鍵而使硅膠具較強的吸附力.硅膠具有微酸性,適用于分離酸性和中性物質(zhì),如有機酸、氨基酸、甾體等.水能與

19、硅膠表面羥基結(jié)合而使其失去活性,經(jīng)加熱可被除去的水稱自由水,若自由水含量達17%以上,則吸附力極低,此時,硅膠只能用于分配層析.若將硅膠在105-110加熱30min,吸附能力顯著增強，這一過程稱為活化.如果將硅膠加熱到500，硅醇基結(jié)構(gòu)會變成硅氧烷結(jié)構(gòu)，吸附能力顯著下降。 2. 氧化鋁氧化鋁 分酸性、堿性和中性三種，酸性氧化鋁(pH4-5)適合于分離酸性化合物，堿性氧化鋁(pH9-10)適合于分離堿性化合物，中性氧化鋁(pH7)適合于分生物堿、揮發(fā)油、萜類、甾體及在酸、堿中不穩(wěn)定的甙類、酯類等化合物.氧化鋁用前也需脫水活化，通常于400高溫下加熱6h,使氧化鋁的含水量在0%-3%之間,可得到

20、級或級氧化鋁，但溫度過高也會破壞氧化鋁的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。3. 大孔吸附樹脂聚酰胺大孔吸附樹脂聚酰胺 大孔吸附樹脂廣泛應用于制藥及天然植物中活性成分,如皂甙、黃酮、內(nèi)脂、生物堿等大分子化合物的提取分離；聚酰胺在黃酮類物質(zhì)、茶多酚、醌以及貴金屬分離提取中有著廣泛的應用。4. 羥基磷灰石羥基磷灰石Ca5(PO4)3OH2，簡稱HA的吸附容量高，穩(wěn)定性好(在T85，pH5.5-10.0均可使用)，因此在制備及純化蛋白質(zhì)、酶、核酸、病毒和其它生命物質(zhì)方面得到了廣泛的應用。( (二二) ) 洗脫劑的選擇洗脫劑的選擇 洗脫劑指的是溶解被吸附樣品和平衡固定相的溶劑。洗脫劑的選擇基本按照“相似相溶”的原則，即：即欲洗

21、脫極性大的組分，選擇極性大的洗脫劑（如水、乙醇、氨等）；極性小的組分宜選用極性小的洗脫劑（如石油醚、乙醚等），并應符合下列條件： 純度較高；穩(wěn)定性好；能較完全洗脫所分離的成分；黏度?。灰缀退枰某煞址珠_。 常用洗脫劑按極性大小順序可排列如下： 石油醚（低沸點高沸點）環(huán)己烷四氯化碳三氯甲烷乙醚甲乙酮二氧六環(huán)乙酸乙酯正丁醇乙醇甲醇水吡啶乙酸。v 洗脫劑可根據(jù)分離物中各成分的極性、溶解度和吸附劑的活性來選擇。所用洗脫劑的濃度大小和極性強弱的選擇，需通過試驗確定。 v 在實踐中，選擇洗脫劑的順序是由極性小到極性大(正向?qū)游?。當把極性小的洗脫劑換成極性大的時，宜先將極性大的和極性小的洗脫劑混合使用，

22、濃度則由低到高?？傊x用洗脫劑的原則是能較完全地洗脫所要分離的成分，并力求用量少、洗脫時間短。 ( (三三) ) 操作方式操作方式1.1.裝柱裝柱 層析柱中基質(zhì)應合乎填裝均勻、松緊一致和沒有氣泡的標準。 裝柱之前基質(zhì)需要預處理。硅膠、氧化鋁主要是高溫脫水活化處理；新購樹脂可能含有分散劑、致孔劑、惰性溶劑等化學殘留，使用前用酸、堿、醇等進行預處理。 吸附劑的用量是根據(jù)其自身的操作容量和分離物中各成分的性質(zhì)決定的。當操作容量高時， 吸附劑用量少。一般吸附劑的用量為被分離樣品的30-50倍。若樣品中各成分的性質(zhì)相似難以分開時，則吸附劑用量應增大，有時大于樣品的100倍。 柱子裝好后，要用所需的緩沖

23、液（有一定的pH和離子強度）平衡柱子。氣泡的產(chǎn)生與排除氣泡的產(chǎn)生與排除v氣泡產(chǎn)生原因氣泡產(chǎn)生原因v由于溶劑和吸附劑之間的吸附放熱（可以用手摸柱子明顯感覺到），容易產(chǎn)生氣泡，這一點在使用低沸點的淋洗劑時如乙醚，二氯甲烷更為明顯。雖然產(chǎn)生的氣泡在加壓的情況下不易察覺，但是，一旦撤去壓力，如在上樣、加溶劑等操作的時候，氣泡就會釋放出來，嚴重時，整個柱子變花。另外，在變換洗脫劑時，由于溶劑極性的改變頁容易產(chǎn)生氣泡；天氣太熱，溶劑揮發(fā)也易產(chǎn)生氣泡。v排除對策排除對策：v 1.裝柱之前應攪拌均勻，然后裝柱；v 2.裝柱盡可能一次性的裝完，v 3.一定要用較多的溶劑“走柱子”，一定要到柱子的下端不再發(fā)燙，恢復到室溫后再撤去壓力v 4.過柱的時候，你是否干過柱，這也會產(chǎn)生氣泡；v 5.還有你在裝完柱后，最好在硅膠上方加一片圓形濾紙，加上后再加一塊棉花，這樣加溶劑沖洗時，可以避免沖起硅膠，產(chǎn)生氣泡；v如果氣泡已經(jīng)產(chǎn)生，可以：v