樹舌子實(shí)體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究

1、樹舌子實(shí)體多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及抗腫瘤活性研究樹舌Ganodermalipsiense（Batch）G.F.Atk,.Syn.G.applanatum（pers.）Pat.;Elfvingiaapplanate（Pers.）Karst.又名“平蓋芝”、“扁靈芝”,屬靈芝科靈芝屬真菌,其全國(guó)分布廣泛;其性平,味微苦,在中醫(yī)中已有幾千年的藥用歷史。樹舌子實(shí)體多糖是樹舌的重要活性成分,具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物活性,但在其抗腫瘤機(jī)制方面的深入研究不多,本論文主要通過四部分試驗(yàn)研究以期闡明樹舌子實(shí)體多糖的抗腫瘤機(jī)制及抗腫瘤過程中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。一:樹舌子實(shí)體多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表

2、征響應(yīng)面法和單因素試驗(yàn)對(duì)樹舌子實(shí)體粗多糖的熱水浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化;所得樹舌子實(shí)體粗多糖通過DEAE-SepharoseFastFlow離子交換層析和SephacyralS-300HR凝膠柱層析繼續(xù)純化，得到多糖GAP-3s高效凝膠滲透色譜（HPGPC分析GAP-3s的分子量，高效液相（HPLC分析GAP-3s的單糖組成，并對(duì)GAP-3s進(jìn)行紅外光譜分析。結(jié)果:單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化樹舌子實(shí)體粗多糖的熱水浸提工藝條件:液料比43（mL/g）、提取時(shí)間4.5h、提取溫度100,在此工藝參數(shù)下樹舌子實(shí)體多糖的提取率為5.03%;純化后所得樹舌子實(shí)體多糖GAP-3S勺分子量為6.82?10<s

3、up>5</sup>Da,主要由葡萄糖（60.1%）、半孚L糖（22.1%）、巖藻糖（9.3%）和木糖（8.5%）組成；紅外光譜分析顯示，GAP-3s含有B-味喃糖等結(jié)構(gòu)。二:GAP-3s對(duì)MCF-握田胞的作用不同濃度GAP-3S（0,125,250,500仙g/mL）處理MCF-7細(xì)胞后，通過MTTt測(cè)定MCF-割胞的增殖率；PI單染、Hoechst33258、AnnexinV-FITC/PI雙染等確定GAP-3s寸MCF-7細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期阻滯的影響；熒光定量PCRM定凋亡相關(guān)基因mRNA1達(dá)水平;WesternBlotting測(cè)定MCF-7細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平;試

4、劑盒檢測(cè)Caspase-3、-8、-9蛋白活性。結(jié)果:GAP-3s能夠以劑量及時(shí)間依賴的方式抑制MCF-7細(xì)胞的增殖；Hoechst33258染色法、結(jié)晶紫染色法觀察細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞劃痕法觀察細(xì)胞遷移率等一系列形態(tài)學(xué)研究結(jié)果表明，GAP-3s能夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)染色質(zhì)固縮、邊緣羽化及遷移能力下降，同時(shí)能使MCF-7細(xì)胞細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期周期阻滯、增加MCF-7細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例；熒光定量PCPffiWesternBlotting結(jié)果表明GAP-3S|g夠顯著上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白P53、P21、Cleaved-Caspase-3、Caspase-9和Cleved-PARP蛋白表達(dá)量，從基因和

5、蛋白水平確定GAP-3蘸夠誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡;GAP-3s同樣能夠增加Caspase-3、Caspase-9蛋白活性,與上述蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果一致,但Caspase-8活性無明顯變化，表明線粒體凋亡途徑可能在GAP-3sB導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。三:GAP-3s誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的線粒體機(jī)制13c劑盒測(cè)定不同濃度GAP-3S(0,125,250,500仙g/mL)處理MCF-7細(xì)胞后,MCF-7細(xì)胞的RO弟量、Ca²⁺fc®、線粒體跨膜電位、抗氧化酶活性的變化；WesternBlotting分析GAP-3s寸MCF-

6、7ffl月fiBax、Bcl-2、胞漿和線粒體中Cyt-C蛋白表達(dá)水平的影響；實(shí)時(shí)熒光定量PCRWJ定Bax和Bcl-2mRNAfe達(dá)水平。結(jié)果:GAP-3s能夠破壞MCF-7細(xì)胞線粒體膜電位，增加MCF-7細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及RO的量；增加抗氧化酶SODGPX舌性，抗氧化劑GSK量上升;GAP-3s能夠顯著增加促凋亡蛋白Bax的mRNA口蛋白表達(dá)量，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的mRN相蛋白表達(dá)量，同時(shí)GAP-3蘸夠影響MCF-7細(xì)胞中Cyt-C亞細(xì)胞定位，促進(jìn)Cyt-C由線粒體向胞漿中的釋放；以上結(jié)果提示，線粒體凋亡途徑在GAP-3s誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡過程中扮演重要作用。四:GAP-3s對(duì)M

7、CF7田月fiMAP奴NF-kB信號(hào)通路的影響試劑盒檢測(cè)GAP-3s處理MCF-7細(xì)胞后NF-kB核移位情況；WesternBlotting檢測(cè)IkB、P3&JNKERKRp-IkBp-P38、p-JNK、p-ERK的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：GAP-3s能夠增加MAPKSC族與炎癥和凋亡相關(guān)成員P3&JNK的磷酸化水平，降低與增殖分化相關(guān)成員ERK的磷酸化水平,表明MAPK妊GAP-3s刺?MMCFP-7細(xì)胞后胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用；GAP-3s能夠增加IkB蛋白的磷酸化水平，促進(jìn)p65蛋白的核移位，從而激活NF-kB信號(hào)通路，表明NF-kB信號(hào)通路同樣參與了GAP-3SSRMMCF-7細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。綜上所述，樹舌子實(shí)體多糖GAP-3s乍用MCF-7細(xì)胞后，能夠刺激MCF-7細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)反應(yīng)，MCF-7