氘代同位素內(nèi)標氣相色譜_質(zhì)譜法測定魚貝類肌肉中_雌二醇殘留

1、氘代同位素內(nèi)標氣相色譜2質(zhì)譜法測定魚貝類肌肉中2雌二醇殘留鄒龍林洪3江潔(中國海洋大學食品科學與工程學院,青島266003摘要建立了不同魚貝類肌肉組織中以氘代同位素為內(nèi)標測定2雌二醇殘留量的氣相色譜/質(zhì)譜(GC /M S 方法。樣品中加入內(nèi)標2雌二醇2D 2和乙酸鈉緩沖溶液勻質(zhì)后,用乙腈超聲提取,經(jīng)過正己烷脫脂,C 18固相萃取柱凈化和柱前三甲基硅烷化后,進行GC /M S 分析。根據(jù)2雌二醇和內(nèi)標衍生物保留時間、主要特征離子及其相對豐度和平均質(zhì)譜圖定性;選擇離子監(jiān)測(SI M 模式下,根據(jù)2雌二醇和內(nèi)標衍生物定量離子質(zhì)量色譜圖的峰面積比值,內(nèi)標標準曲線法定量。實驗結(jié)果表明,在0.0050.2

2、5mg/L 范圍內(nèi),衍生物定量離子峰面積比值與2雌二醇濃度呈現(xiàn)良好線性關系,相關系數(shù)為0.9995;方法定量檢出限為0.2g/kg 。當添加水平為0.25.0g/kg 時,回收率為68.5%100.1%,相對標準偏差為4.8%10.1%。通過對市場上7種魚貝類的檢測,進一步證明該法可實現(xiàn)對樣品進行靈敏、準確的定性定量分析。關鍵詞雌二醇,水產(chǎn)品,氘代內(nèi)標,衍生化,固相萃取,氣相色譜2質(zhì)譜2006210219收稿;2007203207接受本文系本文系農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準“水產(chǎn)品中雌二醇殘留量的測定2氣相色譜2質(zhì)譜法”基金資助項目(No .473E 2mail:linhongouc .edu .cn1引言

3、雌二醇(ES 是一種天然雌激素,屬于甾類同化激素,有和兩種構(gòu)型。由于2雌二醇為生物學效應最強的內(nèi)源性雌激素而被廣泛應用于臨床1;ES 具有較強的蛋白質(zhì)同化作用,能促進動物生長,并可使動物單性化,減少過度繁殖,提高產(chǎn)量,而被用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)2。但2雌二醇可在動物組織內(nèi)形成殘留,通過食物鏈進入人體,易導致兒童性早熟、男孩女性化,致畸致癌1等,嚴重威脅人類的健康。國外有關尿3、血4、畜禽組織58中2雌二醇殘留檢測的文獻報道較多,但未見對水產(chǎn)品,尤其是魚貝類肌肉組織的專門報道。國內(nèi)關于動物源性食品中該物質(zhì)的殘留量檢測有少量報道9,10,且研究對象只限于一種魚貝類,有其局限性。目前所用的分析方法有放射免疫

4、測定法(R I A 11、高效液相色譜法(HP LC 10、氣相色譜2質(zhì)譜法(GC /MS 39,12和液相色譜2質(zhì)譜法(LC /MS 13等。相比較而言,GC /MS 法比較適合低濃度水平(g/kg 雌二醇的分析。采用適當?shù)难苌夹g和選擇離子監(jiān)測(SI M 模式,即使在魚貝類肌肉組織低目標物濃度、高基質(zhì)背景的情況下,也能消除背景干擾,改善靈敏度,提高檢出限。但目前國內(nèi)尚沒有成熟的針對魚貝類肌肉組織中2雌二醇殘留檢測的GC /MS 確證方法。本研究建立了不同魚貝類肌肉組織中2雌二醇殘留量的GC /MS 測定方法。2實驗部分2.1儀器與試劑6890N /5973I 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國A

5、gilent 公司,配分流/不分流毛細管柱進樣器和GC 2MS 化學工作站;Labor ota 40012efficient 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidol ph 公司;BR4i 高速冷凍離心機(法國Jouan 公司;12通道半自動固相萃取裝置(美國Supelco 公司;氮氣濃縮儀(北京康林科技有限責任公司。2雌二醇(2Estradi ol,W ako 公司,純度97%;2雌二醇2D 2(2Estradi ol 2D 2,Sig ma 公司,純度98%;N 2甲基2N 2三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTF A ,Sig ma 2A ldrich 公司,純度為99%;二硫赤蘚糖醇(DTE,A lfa

6、Aesar 公司,純度為99%;三甲基碘硅烷(T M I S,Fluka 公司,純度98%;乙腈、甲醇、正己烷均為色譜純(Fisher 公司,其余試劑為分析純;Cleanert ODS C 18固相萃取柱(Agela 公司,500g/3L,封端。第35卷2007年7月分析化學(FE NX I HUAXUE 研究報告Chinese Journal of Analytical Che m istry 第7期9839872.2標準溶液配制用甲醇分別配制2雌二醇和2雌二醇2D2標準貯備溶液為100mg/L和200mg/L,-18冰箱避光存放。臨用前,分別用甲醇稀釋成一系列濃度梯度的2雌二醇標準工作溶液

7、和0.05mg/L的內(nèi)標標準工作溶液。取0.2mol/L乙酸鈉溶液237mL和0.2mol/L乙酸溶液63mL,混勻,用冰乙酸調(diào)pH,得到0.2mol/L pH5.2的乙酸鈉緩沖溶液。在無水條件下配制衍生化溶液:0.0020g DTE溶解于1mL MST2F A,然后在液面下加入2L T M I S,混勻,放置過夜后使用,低溫避光防潮密封保存。2.3樣品處理2.3.1勻質(zhì)和提取取魚貝類肌肉組織,用家庭用攪拌器制樣后于-18冷凍保存?zhèn)溆?。準確稱取5.00g試樣于50mL離心管中,加入100L內(nèi)標標準工作溶液及5mL乙酸鈉緩沖溶液,用勻質(zhì)器以18000r/m in勻質(zhì)2次,每次30s后,加入10m

8、L乙腈,充分旋渦混合1m in,室溫下超聲提取15m in。取出離心管,以10000r/m in于4離心10m in,上清液倒入另一離心管中。殘渣中加入10mL乙腈,按上述方法再提取一次,合并上清液。2.3.2凈化加入10mL正己烷,加塞劇烈振蕩12m in,以10000r/m in于4離心5m in,吸棄正己烷層,下層溶液用正己烷重復洗滌一次,合并離心后的溶液于雞心瓶。加入0.5mL正丙醇,于45水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。殘渣中加入1mL乙腈,超聲波清洗瓶壁1m in后,吸至5mL注射器中。再用1mL乙腈提取一次,合并溶液并經(jīng)有機系針頭過濾器過濾,再用水稀釋至10mL。樣液過C18SPE小柱(

9、過柱前,依次用6mL甲醇、3mL0.1%乙酸溶液和3mL水活化,流速控制在12mL/m in。用3mL水洗滌C18柱,棄掉流出液。然后用9mL乙腈洗脫,收集洗脫液,氮氣吹干。2.3.3衍生化在殘渣中準確加入100L MSTF A2DTE2T M I S衍生化試劑,蓋緊塞子并旋渦混合1m in,在60烘箱中反應30m in,冷卻至室溫,于48h內(nèi)進行氣相色譜2質(zhì)譜分析。進行標準溶液的衍生化時,先吸取雌二醇和內(nèi)標標準工作溶液于去活樣品反應瓶(美國Agilent公司中,旋渦混合并氮氣吹干,然后同上進行衍生化反應。2.4色譜和質(zhì)譜條件HP25MS毛細管柱(25m0.32mm0.52m;柱初始溫度120

10、(2m in15/m in2505/m in300(5m in;載氣He(99.999%,流速1.0mL/m in;進樣口溫度250;不分流進樣1L。E I離子源和四極桿溫度分別為230和150;接口溫度280;電離電壓70e V;溶劑延遲3m in;電子倍增器電壓為1106V;掃描質(zhì)量范圍為40500a mu。3結(jié)果與討論3.1樣品處理條件的選擇及優(yōu)化3.1.1提取溶劑的選擇雌二醇難溶于水,在弱極性或中等極性的有機溶劑中有較好的溶解度。嘗試用甲醇2緩沖鹽溶液、乙腈2緩沖鹽溶液、乙腈、氯仿、二氯甲烷、丙酮及乙醚作為提取溶劑。從提取效率來看,除了氯仿和乙醚在80%以下,其余提取溶劑都相差不大,可

11、達95%以上。但考慮到魚貝類肌肉組織中各種內(nèi)源性雜質(zhì)多,蛋白質(zhì)和油脂含量較高的特點,而乙腈對動物蛋白具有良好的沉淀作用,與其它溶劑相比,對脂類化合物的溶解度較小;實驗中發(fā)現(xiàn),在對雌二醇低濃度尤其是接近檢出限的樣品進行定量時,基質(zhì)中有與雌二醇基峰離子(m/z416相同的碎片離子,嚴重干擾雌二醇的定量。所以,先加入緩沖液不僅可以調(diào)節(jié)溶液pH為酸性,使雌二醇保持分子狀態(tài),而且把產(chǎn)生干擾碎片離子的堿性物質(zhì)去除了,便于定量離子的選擇。故本方法選用乙腈2乙酸鈉緩沖溶液(pH5.2作為雌二醇的提取溶劑。3.1.2C18柱凈化在文獻6,7中,大多根據(jù)雜質(zhì)的性質(zhì)采用23種不同填料的SPE小柱進行凈化。本實驗通過

12、優(yōu)化條件,選用一種填料的SPE小柱,既減少成本,又能達到較好的凈化效果。上樣前用水進行適當?shù)南♂屢越档鸵译娴膹姸?使雌二醇能夠保留在SPE小柱上。在其它條件相同的情況下,比較了不同類型、不同種類填料和不同填料量C18固相萃取柱對2雌二醇回收率的影響,結(jié)果見489分析化學第35卷表1。通過比較,最終選擇了回收率最高的Cleanert ODS C 18固相萃取柱(500g/3L,封端。表1固相萃取柱提取效率的比較Table 1Comparis on of the extracti on efficiency of different SPE cartridges種類Kind 安捷倫Accubond

13、 (Agilent Accubond 500mg200mg 艾杰爾Cleanert (Agela Cleanert 封端200mg Capped 200mg 未封端500mg not 2capped 500mg 封端500mg Capped 500mg 回收率Recovery (%86.194.996.799.399.8注(notes :未封端(not 2capped ,填料表面存在較多的硅醇官能團,能提供額外的極性相互作用(existence of many silanol functi onal gr oup s with extra polar interacti on on the s

14、urface of filler ;封端(capped ,則反之(absence of silanol functi onal gr oup s with extra polar interac 2ti on on the surface of filler 。3.1.3衍生化條件的選擇雌二醇及氘代物結(jié)構(gòu)中含有芳環(huán),側(cè)鏈C 3、C 17為極性基團,低揮發(fā)性,因此不適合直接進行GC /MS 分析。常用的解決辦法就是將其C 3、C 17羥基衍生化(硅烷化、?；屯榛癁槊杨?bis 2O 2T MS 。實驗中選用了七氟丁酸酐(HF BA 、N 2甲基2N 2三甲基硅基三氟乙酰胺(MSTF A 和M

15、STF A 2T M I S 2DTE 3種衍生化試劑進行比較。結(jié)果表明,MSTF A 2T M I S 2DTE 能把雌二醇及氘代物的兩個羥基定量硅烷化,且衍生化條件溫和、速度快、效率高,能得到較強的分子離子峰(見圖1。T M I S作為催化劑,加速衍生化反應;DTE 是抗氧化劑,能使衍生化溶液穩(wěn)定14。由于衍生化試劑遇水立即分解,因此在操作中應特別注意防潮。衍生化反應在室溫下也能進行,但重復性差6,參照文獻14以及實驗證明,選擇衍生化溫度為60。在其它條件相同的情況下,將2雌二醇標準衍生反應不同時間。結(jié)果表明,反應時間在2045m in 時 ,衍生反應比較完全,時間過長,反應副產(chǎn)物增加,比

16、值降低。因此,采用30m in 為反應時間。圖12雌二醇(a 和2雌二醇2D 2(b 三甲基硅烷化衍生物的結(jié)構(gòu)和E I 全掃描質(zhì)譜圖Fig .1Structure and E I full scan mass s pectra of tri m ethylsilylated 2estradi ol (a and 2estradi ol 2D 2(b 將衍生后的2雌二醇標準和樣品溶液放置不同時間后測定。結(jié)果表明,由于基質(zhì)作用的存在,樣品溶液衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性比標準溶液差。標準溶液衍生產(chǎn)物,在96h 內(nèi)峰面積不顯著變化;而樣品溶液衍生產(chǎn)物,盡管不同濃度之間峰面積變化沒有明顯差異,但都在48h 后,有或

17、多或少的降低。因此,衍生反應后,盡量在48h 內(nèi)進行氣相色譜2質(zhì)譜分析。3.2GC 2M S 分析結(jié)果為了使目標峰與試劑及其它干擾因素峰分開,采用程序升溫進行GC 色譜分離(見圖221,MS 提高檢測的選擇性和靈敏度。盡管如此,在全掃描模式總離子流色譜圖(TI C 上,由于魚貝類肌肉組織本底基質(zhì)復雜,加上目標化合物濃度很低,峰形不好,甚至被本底掩蓋。為此,實驗在SI M 模式下通過提取離子流色譜圖(extracted i on chr omat ography 對目標化合物進行追蹤,消除很大一部分的背景干擾,利用保留時間和衍生物主要特征離子及其相對豐度進行定性分析(見表2。雖然2雌二醇/2雌二

18、醇2D 2衍生物在全掃描TI C 上不能基線分離,但可以通過兩者的特征碎片離子,在SI M 模式下利用質(zhì)量色譜圖對它們進行“分離”和準確定量。如圖222和圖223所示,2雌二醇/2雌二醇2D 2衍生物定量離子沒有受到樣品基質(zhì)碎片離子的干擾,峰形良好,顯著提高了信噪比。589第7期鄒龍等:氘代同位素內(nèi)標氣相色譜2質(zhì)譜法測定魚貝類肌肉中2雌二醇殘留表2SI M 模式下2雌二醇和2雌二醇2D 2衍生物及其特征診斷離子Table 2Derivatives of 2estradi ol and 2estradi ol 2D 2and their diagnostic i ons acquired in

19、selected i on monit oring (SI M mode組分Analyte 分子量Molecular weight 保留時間Retenti on ti m e (m in 衍生物DerivativeT MS 衍生物特征診斷離子D iagnostic i ons of T MS 2derivative f or 定量離子Screeningm /z 確證離子Confir mati on m /z m /z 衍生物碎片離子Derivative frag menti on2ES 27215.410.10bis 2O 2T MS 416416(100,285(74,326(16,232(

20、14M +2ES 2D 227415.400.10bis 2O 2T MS 418-M +3:括號內(nèi)為相對強度(the number in parentheses is relative intensity 。T MS:tri m ethylsilyl .圖2標準及樣品色譜圖Fig .2Chr omat ogra m s of standards and sa mp les1.全掃描模式下2雌二醇和2雌二醇2D 2標準溶液的總離子流色譜圖(t otal i on chr omat ogra m of standard 2estradi ol and2estardi ol 2D 2in full

21、 scan mode ; 2.選擇離子模式下添加于鯽魚肉中2雌二醇(5g/kg 衍生物定量離子的質(zhì)量色譜圖(extracted i on chr omat ogra m of a crucian meat sa mp le s p iked with 5g/kg 2estradi ol in SI M mode ; 3.選擇離子模式下添加于鯽魚肉中2雌二醇2D 2(1g/kg 衍生物定量離子的質(zhì)量色譜圖(extracted i on chr omat ogra m of a crucian meatsa mp le s p iked with 1g/kg 2estardi ol 2D 2in

22、SI M mode 。3.3方法評價實驗采用內(nèi)標標準曲線法定量。配制濃度為0.005、0.01、0.03、0.05、0.1和0.25mg/L 2雌二醇標準溶液,取100L 不同濃度的該標準溶液,分別加入100L 內(nèi)標標準工作溶液,衍生化,GC /MS 測定后,以雌二醇與內(nèi)標衍生物的定量離子峰面積比值為縱坐標,標準溶液濃度為橫坐標作圖,得到內(nèi)標標準工作曲線。結(jié)果表明,2雌二醇在濃度為5250g/L 的范圍內(nèi)呈良好的線性關系,線性方程為y =12.623x +0.1741,相關系數(shù)為0.9995。以空白樣品加標,S /N =10所對應的2雌二醇的濃度求得方法定量檢出限為0.2g/kg 。在空白魚貝

23、類肌肉組織基質(zhì)(鲅魚、鯽魚、刀額新對蝦中進行3個濃度水平的添加回收實驗,結(jié)果見表3。表32雌二醇在不同魚貝類肌肉組織基質(zhì)中的回收率(n =5Table 3Recoveries of 2estradi ol in muscle tissue matrices of different fishes/shellfishes (n =5樣品Sa mp le 添加水平Sp iked level (g/kg 檢出量Found (g/kg 平均回收率Recovery mean (%,n =5相對標準偏差RS D (%,n =5鲅魚Japanese s panish mackerel 5.04.2985.8

24、 5.01.00.7777.3 574.88.0鯽魚Crucian 5.04.6392.6 4.81.00.830.1576.8 6.6刀額新對蝦Greasy 2back shri m p5.04.7494.9 6.91.00.6783.87.00.20.1577.710.13.4樣品分析為考察本方法的適用性,按上述實驗方法對市售的鮮活魚貝類進行了抽檢,樣品包括鯽魚、鰻魚、草689分析化學第35卷魚、鯉魚、鱈魚、鲅魚和刀額新對蝦。結(jié)果顯示,除雌性刀額新對蝦外,其它6種魚貝類肌肉組織中均未檢測出2雌二醇。References1Hu W ei (胡偉,Huan

25、g Rongbin (黃榮斌,Chen Xiaojun (陳小君,J in Hong mei (金紅梅.A nalysis and TestingTechnology and Instrum ent (分析測試技術與儀器,2001,7(1:41442W ang Zhanyun (王占云.Journal of M inxi V ocational College (閩西職業(yè)大學學報,1999,4:28303Daeseleire E,Vandeputte R,Peteghem C V.A nalyst ,1998,123:259525984Giancarl o B,Robert o A,Pietr

26、 o T,Massi m iliano S,M aur o S,Federico G .Journal of M ass Spectro m etry ,2002,37(12:126612715Fuh M R,Huang S Y,L in T Y .Talanta ,2004,64:4084146Seo J,Ki m H Y,Chung B C,Hong J.J.Chro m atogr .A ,2005,1067:3033097Hart m ann S,Steinhart H.J.Chro m atogr .B ,1997,704:1051178M archand P,B izec B L

27、,Gade C,Andre F .J.Chro m atogr .A ,2000,867:2192339W ang Yufei (王玉飛,Zhou Ka (周凱,L i J ige (李繼革.Chinese Journal of Health L aboratory Technology (中國衛(wèi)生檢驗雜志,2006,16(1:212310W ang L ingyun (王凌云,L i J iezhen (李潔珍,L iM in (黎敏,L i Lezhen (李樂珍.Che m ical A nalysis and M eterage(化學分析計量,2005,14(4:384011Zhou

28、B in (周斌,Sun Zhenping (孫鎮(zhèn)平,ZhangWenye (張文曄.Apiculture of China (中國養(yǎng)蜂,2002,53(5:6712Chen J ie (陳捷,Q in Yan (秦燕,ZhangMeijin (張美金.Chinese Journal of Chro m atography (色譜,2006,24:192213Q in Yan (秦燕,Chen J ie (陳捷,ZhangMeijin (張美金.Chinese J.Anal .Che m.(分析化學,2006,34(3:29830214W ang Zhengfan (汪正范,Yang Shu

29、m ing (楊樹明,W u Moutian (吳侔天,Yue W eihua (岳衛(wèi)華.Chro m atographyCoupling Technology (色譜聯(lián)用技術.Beijing (北京:Che m ical I ndustry Press (化學工業(yè)出版社,2000:7893D eterm i n a ti on of 2Estrad i ol Resi dues i n F ish /Shellf ish M uscleT issues by Ga s Chro ma tography 2M a ss Spectrom etryZou Long,L in Hong 3,J i

30、ang J ie(College of Food Science and Engineering,O cean U niversity of China,Q ingdao 266003Abstract U sing deuterated internal standard,a gas chr omat ography 2mass s pectr ometric method (GC 2MS was devel oped f or the identificati on and quantitative deter m inati on of 2estradi ol residues in the muscle tissues of vari ous fishes/shellfishes .Homogenized tissue sa mp les added with 2estradi ol 2D 2and acetate buffer (pH 5.2were extracted by acet onitrile under ultras onicati on .Clean 2up was carried out with hexane,foll owed by C 182s olid phase extracti on (SPE .T o enhance