慢性排斥反應移植體動脈硬化與增殖細胞核抗原表達

1、    慢性排斥反應移植體動脈硬化與增殖細胞核抗原表達        【摘要】目的探討慢性排斥反應移植動脈硬化與增殖細胞核抗原(PCNA)表達的關系。方法采用免疫組化SP法研究61只大鼠的移植動脈，10例慢性排斥反應移植腎動脈組織中的PCNA表達。結果實驗組：在大鼠移植動脈中層PCNA術后7天達最高峰，內膜層術后20天達最高峰，且細胞數(shù)明顯增多，兩者呈正相關。臨床組：移植腎動脈PCNA表達主要集中在內膜，其次為中層，外膜極少。結論移植動脈硬化過程中細胞增殖與PCNA表達關系密

2、切。慢性排斥的移植腎動脈PCNA呈高表達。且與術后早期急性排斥反應的發(fā)生頻率及程度密切相關。【關鍵詞】移植物排斥動脈硬化動物，實驗 Expression of PCNA in the transplant arteriosclerosis of chronic rejectionLI Qiansheng,QIAO Zhuoyi,FANG Yuhuan,et al.(Renal Transplantation Center,Daping Hospital,the Third Military Medical University,Chongqing 400042,China)【Abstract】

3、ObjectiveTo investigated the relationship between the expression of PCNA and transplant arteriosclerosis of chronic rejection.MethodsThe expression of PCNA in the allograft arteriosclerosis of 61 rats and the transplant renal artery in 10 patients of chronic rejection were studied with immunohistoch

4、emistry SP method.ResultsIn the experiment group,the expression of PCNA in the media of transplant aorta showed a peak at 7 days postoperative,the intimal PCNA showed a peak at 20 days and the cell numbers increased.The expression of PCNA and the cell numbers showed a positive correlation.In the cli

5、nical group,the expression of PCNA was mainly found in the intimal membrane of transplant renal artery,the next was in the media,where as the exomembrane showed a few.ConclusionsThere was a close relationship between the increase of expression of PCNA and the cell proliferation.The expression of PCN

6、A in the transplant artery of chronic rejection increased.It had significant relationship with the frequency or the degree of acute rejection.【Key words】Graft rejectionArteriosclerosisAnimals,laboratery移植體動脈硬化是慢性排斥反應的主要病理學特征之一。目前，在移植動脈硬化過程中細胞增殖進程與原癌基因的表達尚缺乏了解。為明確血管細胞增殖DNA復制與增殖細胞核抗原(PCNA)表達的相互關系，我們在建

7、立標準慢性排斥反應動物模型基礎上，對移植體動脈硬化與PCNA表達作了實驗與臨床觀察。動物實驗一、實驗分組雄性Wistar及SD系大鼠，月齡24個月，體重120250g。同系移植對照組(Wistar-Wistar)22只，異系移植實驗組(SD-Wistar)39只。所有動物購買時均證實健康未攜帶病毒，術前一周單籠飼養(yǎng)，飼料不含膽固醇及脂質。二、血管移植取供鼠腹主動脈1.01.5cm，肝素鹽水沖洗后置腎保存液中4冰箱保存。于受鼠腎動脈分支下方至髂動脈分支上方解剖斷離該段腹主動脈，將供鼠動脈原位對端吻合于受鼠腹主動脈。三、材料與方法腎保存液為上海中心輸血站產品，鼠抗人PCNA單克隆抗體由丹麥DAKO

8、公司提供。取移植動脈各時相點為術后3、7、14、20、30及60天。用SP法對各點標本分別進行PCNA檢測，計算其陽性率。陽性細胞評定標準：PCNA陽性細胞為細胞核內有棕黃色顆粒，除核內有染色外，胞漿也有擴散。每只動物取三張切片，鏡下分別計數(shù)血管中層及內膜著色的細胞數(shù)和未著色的細胞數(shù)，取平均值。即陽性率=(陽性細胞數(shù)÷細胞總數(shù))×100%。四、統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)用<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100312170610846" 12 14>±s表示，統(tǒng)計學方法采用t檢驗

9、，方差分析及相關分析用Microexcel數(shù)據(jù)軟件。五、結果1.對照組：由于無明顯的內膜增生，各時相點PCNA表達均為陰性。2.實驗組：血管中層，術后3天即出現(xiàn)PCNA陽性細胞，術后7天達高峰，在靠近內膜下區(qū)域分布較多，術后14天開始下降，此時PCNA陽性細胞不再局限于內膜下，而是廣泛分布于中層各處。術后30及60天，中層僅存少量散在的PCNA陽性細胞。內膜：當術后14天內膜出現(xiàn)增生時，PCNA在內膜表達相當突出，術后20天達頂峰，說明此時細胞在內膜的增殖達高峰。PCNA陽性細胞在內膜分布不均，細胞成分較多處，PCNA陽性細胞較多。術后30天開始下降，且多分布于內膜層近腔面區(qū)域。術后60天細胞

10、數(shù)急劇下降并僅少量殘存。PCNA表達與內膜細胞數(shù)呈正相關，相關系數(shù)為0.85(表1)。表1大鼠動脈異系移植PCNA陽性率表達變化(<"0 (881 bytes)" src="/med/cano/201003/20100312170610846" 12 14>±s，%)時相點(術后，天)內膜中層3051±157063±461425±927±222073±2412±103036±217±5609±70    

11、 與同組前一時相點比較，差別有顯著性意義，P0.05臨床研究一、研究對象收集10例同種腎移植術后19年移植腎失功病理診斷為慢性排斥反應并行腎切除的移植腎標本。男8例，女2例。年齡2355歲。腎移植術后3個月內發(fā)生急性排斥反應1次3例，2次4例，3次1例，不詳2例。5例正常腎組織為對照組。二、材料與方法與實驗組相同，即取移植腎動脈12級分支，采用SP法行PCNA免疫組化檢測。三、結果1.PCNA表達形式：在光鏡下顯示移植腎動脈硬化血管中PCNA陽性細胞染色呈棕黃色顆粒，呈彌散狀或混合狀分布，不規(guī)律地表達于胞漿、胞核及胞膜，胞漿內以混合型多見，核內分布以彌散狀顆粒為主。血管壁各層均可見大量炎性細胞

12、，其中以內膜占相當大的比例，包括單核、巨噬細胞及T細胞。對照組未見PCNA陽性細胞。2.PCNA表達部位及其陽性率：血管壁內膜、中層及外膜PCNA陽性表達率分別為90%、50%及10%。表明排斥反應時血管PCNA表達主要集中在內膜，其次為中層，外膜極少，差別有顯著性意義，P0.05。3.PCNA表達強度與急性排斥發(fā)生頻率關系：腎移植術后發(fā)生急性排斥1次3例，血管內皮細胞PCNA陽性表達率為31%，2次4例，陽性細胞表達率63%，3次1例，陽性細胞表達率80%。即急性排斥發(fā)生頻率越高，PCNA陽性細胞表達率越明顯，P0.05。討論一、PCNA來源、表達形式及部位PCNA作為評價細胞增殖狀態(tài)的一個

13、重要指標，近年來已廣泛開展。本實驗在異系移植動脈硬化研究中發(fā)現(xiàn)，PCNA在血管的內、中、外層均有不同程度的表達，且主要集中在內膜及中層，染色呈棕黃色顆粒，彌散狀或混合狀分布，不規(guī)律地表達于胞漿、胞核及胞膜。胞漿內以混合型顆粒為主，核內以彌散狀顆粒為主。外膜有大量炎性細胞浸潤，PCNA有不均勻少量的表達。因外膜中不存在平滑肌細胞增生，故推測PCNA來源于內皮細胞、單核及巨噬細胞1。二、PCNA表達與動脈硬化的關系本實驗發(fā)現(xiàn)移植后14天，內膜出現(xiàn)增生層，內膜細胞PCNA陽性表達率為25%±9%，術后20天達最高峰為73%±24%，且伴隨平滑肌細胞由中層向內膜遷移以及遷移后細胞增

14、生。此后PCNA表達陽性率逐漸下降。而在血管中層術后7天PCNA陽性率達最高峰63%±24%。以后逐漸下降，反映出術后2周出現(xiàn)的“中層壞死”現(xiàn)象。由此推測，中層PCNA陽性表達多為平滑肌細胞。有人認為，移植動脈中層壞死與內膜增生其主要因素與中層平滑肌細胞向內膜遷移有關2。某些細胞因子如IGF-1，PDGF及TGF-b，或白介素及炎癥脂質介質等可促進平滑肌細胞的遷移3。本組10例移植腎慢性排斥的動脈硬化標本中可見血管各層均有炎性細胞浸潤。如單核、巨噬細胞及T細胞，尤以內膜更為顯著。PCNA表達也主要集中在內膜，其次為中層。雖然由于人類腎移植術后免疫抑制劑的應用，中層壞死炎性細胞浸潤程度

15、、PCNA表達程度均較動物實驗低，但炎性細胞的浸潤與內膜PCNA表達及細胞增生導致動脈硬化的關系密切。三、PCNA高表達與急性排斥之間的關系腎移植術后急性排斥發(fā)生頻率及強度是導致慢性排斥的主要危險因素4。在移植動脈硬化的過程中，當給予免疫抑制劑抑制急性排斥的發(fā)生，內膜增生可明顯受到抑制。Almond等5報告術后早期使用MMF，內膜增生較對照組低76.3%。本組急性排斥8例移植腎動脈標本中發(fā)現(xiàn)，急性排斥發(fā)生的頻率越高，內膜增生越顯著。增生形式有半月狀或同心圓狀，嚴重者管腔完全閉塞。因此，我們認為，腎移植術后急性排斥是導致移植腎動脈硬化的重要因素。一旦發(fā)生，其改變不可逆轉。四、PCNA表達的啟動因

16、素與增生的關系1.炎性細胞的浸潤：炎性細胞通過不相容MHC抗原識別，釋放淋巴因子(IL-1等)，通過其免疫介導，使其產生PCGF，TGF-等生長因子，PCNA表達增強，DNA大量復制合成，出現(xiàn)細胞增生6。2.缺血與再灌注損傷：一般認為，在冷缺血時間較短的情況下，缺血/再灌注損傷對移植動脈硬化影響不大。相反，供體長時間缺血，或再灌注性損傷，均可導致氧自由基的活化降低。脂蛋白氧化7，刺激細胞及生長因子，促使內膜增生及動脈硬化。3.感染：術后早期感染，血管外膜炎性細胞浸潤，可使內膜增生程度加倍。而術后晚期的CMV感染可通過增強PDGF-BB及TGF- mRNA的表達，導致內膜增生8。我們認為，移植體

17、動脈硬化過程中細胞增殖是多因素作用的結果，而PCNA的表達乃是細胞增殖的主要分子病理學基礎。因腎移植術后使用免疫抑制劑，使PCNA的表達強度較實驗動物弱。作者單位：李黔生(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)喬著意(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)方玉華(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)徐序廣(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)靳風爍(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)朱方強(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)

18、院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)萬江華(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)姜慶(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)吳剛(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)靳文生(第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所泌尿外科洗腎移植中心重慶，400042)參考文獻1，Alprs CE,Davis CL,Barr D,et al.Identification of platelet-derived growth factor:a and b chains in human

19、renal vascular rejection.Am J Pathol,1996,148439-442.2，Mennander A,Pavoner J,Harry P.Intimal thickening and medial necrosis in allograft arteriosclerosis and independently regulated.Arterioscler Thromb,1993,71019-1025.3，Harry P,Mennander A,Tilsala S,et al.Rat aortic allografts:an experimental model

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