細(xì)胞培養(yǎng)及材料細(xì)胞毒性檢測(cè)

1、前言細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念細(xì)胞培養(yǎng)的基本條件細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法細(xì)胞培養(yǎng)的污染和檢測(cè)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇細(xì)胞管理及保藏細(xì)胞毒性檢測(cè) Wilhelm Roux (1850-1924 ) 1885年年Roux最早嘗試使組最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。并首次采用組織培養(yǎng)這個(gè)術(shù)語(yǔ)。1.1.前言前言Alexis CarrelFranceRockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USAb. 1873d. 1944 1907年年Harr

2、ison 和和1912年年Carrel開(kāi)始把組織培養(yǎng)作為一開(kāi)始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)種方法，用于研究離體動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)。胞的培養(yǎng)。 他建立的雞胚胎成纖維細(xì)胞他建立的雞胚胎成纖維細(xì)胞持續(xù)了持續(xù)了34年之久年之久(1912-1946) 器官培養(yǎng) (Organ culture)：將活體中整個(gè)器官或一部分器官取出，置于體外生存、生長(zhǎng)并同時(shí)保持其一定的結(jié)構(gòu)和功能特征。組織培養(yǎng) (Tissue culture)：把活體的一小片組織（O.51立方毫米）置于底物上孵育，細(xì)胞自其周圍移出并生長(zhǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)：把提取的組織用機(jī)械或消化的方法分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，后進(jìn)行培養(yǎng)

3、，增殖。腫瘤腫瘤胚胎胚胎成體成體粗切粗切消化消化細(xì)切細(xì)切修切修切細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng)器官培養(yǎng)器官培養(yǎng)活細(xì)胞活細(xì)胞便于觀察檢測(cè)便于觀察檢測(cè)條件可控條件可控均一性均一性便于人工篩選便于人工篩選失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，趨向單一性失去原有組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)，趨向單一性分化減弱分化減弱可能獲得不死性可能獲得不死性貼壁型：動(dòng)物的正常細(xì)胞貼壁型：動(dòng)物的正常細(xì)胞懸浮型：血液淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、植物細(xì)胞懸浮型：血液淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、植物細(xì)胞固定化培養(yǎng)固定化培養(yǎng)來(lái)源：由來(lái)源：由中胚層間充質(zhì)組織起源中胚層間充質(zhì)組織起源的組織的組織 如：真正的成纖維細(xì)胞如：真正的成纖維細(xì)胞 心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)

4、胞心肌，平滑肌，成骨細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)：形態(tài)：似體內(nèi)成纖維細(xì)胞似體內(nèi)成纖維細(xì)胞的形態(tài)的形態(tài) 胞體梭形胞體梭形或不規(guī)則三角形或不規(guī)則三角形 胞質(zhì)向外伸出胞質(zhì)向外伸出23個(gè)個(gè)長(zhǎng)短不等的突起長(zhǎng)短不等的突起 中有卵圓形核中有卵圓形核 生長(zhǎng)特點(diǎn)：生長(zhǎng)特點(diǎn)： 排列成排列成放射狀放射狀，漩渦狀，漩渦狀 并不緊靠連成片并不緊靠連成片， 細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而細(xì)胞接觸易斷開(kāi)而單獨(dú)行動(dòng)單獨(dú)行動(dòng) 原代細(xì)胞：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)原代細(xì)胞：從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞的細(xì)胞原代培養(yǎng)：將從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)原代培養(yǎng)：將從體內(nèi)取出的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)行培養(yǎng)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)傳代培養(yǎng)：從原代培養(yǎng)細(xì)胞繼續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)接培養(yǎng)傳代

5、細(xì)胞：在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代細(xì)胞：在體外培養(yǎng)條件下持續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)菌無(wú)菌無(wú)毒、生物相容性無(wú)毒、生物相容性清潔的環(huán)境清潔的環(huán)境品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源，培養(yǎng)基配制使用高純度藥品品質(zhì)良好的細(xì)胞來(lái)源，培養(yǎng)基配制使用高純度藥品和去離子水和去離子水有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法有標(biāo)準(zhǔn)化的工作方法 培養(yǎng)用的液體極多，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，配制濃度準(zhǔn)確，培養(yǎng)用的液體極多，應(yīng)由專人負(fù)責(zé)，配制濃度準(zhǔn)確，所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與所有配好的溶液瓶上都要標(biāo)明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等否和制備日期等一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無(wú)章，一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點(diǎn)，避免雜亂無(wú)章，其中尤其重

6、要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應(yīng)嚴(yán)格分開(kāi)，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放分開(kāi)，已消毒品與未消毒品應(yīng)分別存放無(wú)菌條件無(wú)菌條件：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高：凈化工作室，風(fēng)淋室，傳遞窗，高效過(guò)濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，效過(guò)濾器，潔凈層流罩，生物安全柜，超凈工超凈工作臺(tái)作臺(tái)，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌，紫外燈，電熱干燥箱，濾器，高壓滅菌器，抗生素器，抗生素細(xì)胞生長(zhǎng)條件細(xì)胞生長(zhǎng)條件：培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，：培養(yǎng)板，培養(yǎng)瓶，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)箱，培養(yǎng)基，血清培養(yǎng)基，血清細(xì)胞檢測(cè)條件細(xì)胞檢測(cè)條件：倒置顯微鏡倒置顯微鏡，酶標(biāo)儀，微孔板，酶標(biāo)儀，微孔板震蕩器，高速

7、離心機(jī)，移液器震蕩器，高速離心機(jī)，移液器細(xì)胞保存條件細(xì)胞保存條件：液氮罐，超低溫冰箱：液氮罐，超低溫冰箱超凈工作臺(tái)高壓蒸汽滅菌器過(guò)濾除菌裝置倒置顯微鏡水純化裝置恒溫培養(yǎng)箱電熱干燥箱離心機(jī)、天平、水浴、搖床液氮罐冰箱：4、-20 、-80 移液器移液器移液管移液管吸管吸管培養(yǎng)瓶：培養(yǎng)瓶： 25cm25cm2 2、75cm75cm2 2、150cm150cm2 2培養(yǎng)皿：培養(yǎng)皿： 3030、6060、120120毫米毫米多孔培養(yǎng)板：多孔培養(yǎng)板： 4 4、6 6、2424、9696孔孔離心管離心管凍存管凍存管基礎(chǔ)培養(yǎng)基 8095血清 520青、鏈霉素 各100Uml天然培養(yǎng)基： 血清 血漿 組織提取

8、液（如雞胚和牛胚浸液） 合成培養(yǎng)基： 根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物目前常用培養(yǎng)基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存，要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖，還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 馬血清等優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn) 透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、 病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性） 56 ，30 分鐘。血清的消毒：過(guò)濾除菌其他細(xì)胞培養(yǎng)用液n水：新鮮的三蒸水或去離子水n平衡鹽溶液 主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成 作用：維持滲透壓

9、、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度 常用的緩沖液： 生理鹽水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）n通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，俗稱“雙抗溶液”。n配制 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)U/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)U/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)U。 n使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青、鏈霉素的濃度最終為100U/ml。n慶大霉素：使用終濃度為100U/ml，廣譜、穩(wěn)定。主要作用： 水解與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞分離。常用濃度：0.25% 用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液或D-Hank

10、s配制，用濾器過(guò)濾除菌。消化時(shí)間： 用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用。 物物 品品濕濕 熱熱干干 熱熱過(guò)過(guò) 濾濾紫紫 外外化學(xué)化學(xué)氣體氣體消毒劑消毒劑電離電離輻射輻射培養(yǎng)室培養(yǎng)室工作臺(tái)工作臺(tái)玻璃玻璃制品制品金屬金屬器械器械塑料塑料制品制品橡膠橡膠制品制品培養(yǎng)培養(yǎng)用液用液布類布類棉類棉類 貼附生長(zhǎng)型細(xì)胞 必須貼附于底物才能生長(zhǎng)的細(xì)胞。從形態(tài)上大體分為上皮細(xì)胞型及成纖維細(xì)胞型，還有一些難以確定其穩(wěn)定形態(tài)的細(xì)胞。粘著、粘附粘著、粘附（attachment）鋪展鋪展（spreading)1）取材）取材 切割切割組織塊培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法2）直接購(gòu)買）直接購(gòu)買 培養(yǎng)培養(yǎng)（原代培養(yǎng)）

11、 體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞或細(xì)胞株要在體外持續(xù)地培養(yǎng)就必須傳代，以便獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株或得到大量的同種細(xì)胞，并維持細(xì)胞種的延續(xù)。 培養(yǎng)的細(xì)胞形成單層匯合以后，由于密度過(guò)大生存空間不足而引起營(yíng)養(yǎng)枯竭，將培養(yǎng)的細(xì)胞分散，從容器中取出，以1:2或l:3以上的比率轉(zhuǎn)移到另外的容器中進(jìn)行培養(yǎng)，即為傳代培養(yǎng)。棄去舊培養(yǎng)液棄去舊培養(yǎng)液 清洗清洗 加入消化液加入消化液 吸棄消化液吸棄消化液 加入培養(yǎng)液加入培養(yǎng)液 吹打分散細(xì)胞吹打分散細(xì)胞 分裝稀釋細(xì)胞分裝稀釋細(xì)胞 補(bǔ)加培養(yǎng)液補(bǔ)加培養(yǎng)液 繼續(xù)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)接種數(shù)量為51048105個(gè)/ml。傳代密度太低，細(xì)胞容易死亡，表現(xiàn)出細(xì)胞在達(dá)到增長(zhǎng)前有較長(zhǎng)的滯留期。培養(yǎng)液由于pH下

12、降而呈現(xiàn)黃色，表明細(xì)胞已經(jīng)達(dá)到最大密度需要換液或進(jìn)行傳代培養(yǎng)。如果是單層貼壁的細(xì)胞，等長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶表面，即可進(jìn)行傳代。游離期游離期 懸浮，胞質(zhì)回縮，全部細(xì)胞變?yōu)閳A球形。吸附期吸附期 貼附底物，一般24小時(shí)內(nèi)貼壁。潛伏期潛伏期 此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖。 細(xì)胞株潛伏期一般為624小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng)，活力最佳，最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期（平臺(tái)期）停止期（平臺(tái)期） 細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁后，細(xì)胞雖有活力但不再分裂。 機(jī)制：接觸抑制、密度依賴性肉眼觀察：培養(yǎng)液的顏色和透明度肉眼觀察：培養(yǎng)液的顏色和透明度顯微鏡觀察顯微鏡觀察生長(zhǎng)良好的細(xì)胞：細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)良好的細(xì)

13、胞：細(xì)胞透明度大，折光性強(qiáng)，輪廓不清輪廓不清生長(zhǎng)狀態(tài)不良的細(xì)胞：細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折生長(zhǎng)狀態(tài)不良的細(xì)胞：細(xì)胞輪廓增強(qiáng)，細(xì)胞折光性變?nèi)酰话|(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒光性變?nèi)?；胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質(zhì)；細(xì)胞之間空隙增大；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，狀物質(zhì)；細(xì)胞之間空隙增大；細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落；有甚至失去原有細(xì)胞的特點(diǎn)，產(chǎn)生圓縮脫落；有時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物時(shí)細(xì)胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物每毫升細(xì)胞數(shù)每毫升細(xì)胞數(shù)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞生長(zhǎng)曲線細(xì)胞生長(zhǎng)曲線貼壁率貼壁率有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)(MI)(MI)：分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)：分裂相數(shù)量占全部細(xì)胞數(shù)量的

14、百分比量的百分比細(xì)胞群體倍增時(shí)間細(xì)胞群體倍增時(shí)間四唑鹽四唑鹽(MTT)(MTT)比色法比色法標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷標(biāo)記胸腺嘧啶脫氧核苷( (3 3H-TdR)H-TdR)摻入量摻入量細(xì)胞活力：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比細(xì)胞活力：總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比臺(tái)盼藍(lán)法臺(tái)盼藍(lán)法四唑鹽四唑鹽(MTT)(MTT)比色法比色法熒光素雙乙酸酯法熒光素雙乙酸酯法(FDA)(FDA)四唑鹽（四唑鹽（MTTMTT）比色法）比色法MTT比色法的原理： 活細(xì)胞中琥珀脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臢（formazan)，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒(méi)有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細(xì)胞中藍(lán)紫色結(jié)晶物

15、，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm處產(chǎn)生吸收值，用酶標(biāo)儀測(cè)定A值。細(xì)胞大?。猴@微測(cè)微計(jì)法細(xì)胞大?。猴@微測(cè)微計(jì)法細(xì)胞重量：稱重法細(xì)胞重量：稱重法鮮重鮮重干重干重細(xì)胞固定細(xì)胞固定蘇木精蘇木精- -伊紅染色伊紅染色GiemsaGiemsa染色染色FeulgenFeulgen染色染色考馬斯藍(lán)染色考馬斯藍(lán)染色免疫法免疫法細(xì)胞核染色：細(xì)胞核染色：HoechstHoechst、DAPIDAPI混濁、混濁、pHpH異常改變、細(xì)胞外形異常改變、細(xì)胞外形模糊、漂浮的集落模糊、漂浮的集落細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡細(xì)胞出現(xiàn)增殖緩慢或死亡化學(xué)物質(zhì)的污染化學(xué)物質(zhì)的污染非同種細(xì)胞污染非同種

16、細(xì)胞污染微生物污染：細(xì)菌、真菌、支微生物污染：細(xì)菌、真菌、支原體、病毒原體、病毒培養(yǎng)液變黃，出現(xiàn)渾濁培養(yǎng)液變黃，出現(xiàn)渾濁鏡下可見(jiàn)圓球狀顆粒漂浮鏡下可見(jiàn)圓球狀顆粒漂浮預(yù)防和處理：青霉素、鏈霉素預(yù)防和處理：青霉素、鏈霉素培養(yǎng)液一般不渾濁培養(yǎng)液一般不渾濁白色或黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)基表面白色或黃色小點(diǎn)漂浮于培養(yǎng)基表面光鏡觀察到菌絲光鏡觀察到菌絲預(yù)防和處理：抗真菌劑預(yù)防和處理：抗真菌劑可透過(guò)濾膜無(wú)細(xì)胞壁細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液仍清亮但仍清亮但變黃，細(xì)胞生長(zhǎng)變緩變黃，細(xì)胞生長(zhǎng)變緩，部分細(xì)胞發(fā)生部分細(xì)胞發(fā)生脫落脫落，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿，細(xì)胞間隙可見(jiàn)鋪滿細(xì)沙樣小點(diǎn)細(xì)沙樣小點(diǎn)。預(yù)防預(yù)防重新培養(yǎng)重新培養(yǎng)鑒別鑒別清除：抗生

17、素、加溫、支原體特異性血清、共培養(yǎng)清除：抗生素、加溫、支原體特異性血清、共培養(yǎng)法、重新克隆法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法法、重新克隆法、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法防止交叉污染防止交叉污染慢凍快融慢凍快融低溫保護(hù)劑：低溫保護(hù)劑：10%10%的甘的甘油或二甲亞砜油或二甲亞砜DMSODMSO 細(xì)胞深低溫保存的基本原理： -80以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。 當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步

18、脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜、細(xì)胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。 對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱；細(xì)胞的命名無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫(xiě)字母或代號(hào)命名無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫(xiě)字母或代號(hào)表示。但不論什么形式，均不宜太長(zhǎng)，以便記憶和了解。表示。但不論什么形式，

19、均不宜太長(zhǎng)，以便記憶和了解。HeLaHeLa：為供體患者的姓名：為供體患者的姓名(Henrietta Lacks(Henrietta Lacks，來(lái)源于宮頸癌，來(lái)源于宮頸癌) )CHOCHO：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary)(Chinese Hamster Ovary)NIH/3T3NIH/3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所(National Institute of (National Institute of Health)Health)建立建立, , 每每3 3天傳代一次，每次接種天傳代一次，每次接種3 310106 6細(xì)胞毫升。細(xì)胞毫升。主細(xì)胞庫(kù)主細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)原始細(xì)胞庫(kù)主細(xì)胞庫(kù)生產(chǎn)細(xì)胞庫(kù)ATCC (American Type Culture ATCC (American Type Culture Collection) Collection) ECACC (European Collection of Cell ECACC (European Coll