l胰蛋白酶活力測(cè)定

1、 實(shí)驗(yàn) 胰蛋白酶活力測(cè)定一、原理福林酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸，在堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍(lán)色化合物（鎢藍(lán)和鉬藍(lán)）。蛋白質(zhì)中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林酚試劑反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在一定的范圍內(nèi)，藍(lán)色化合物顏色的深淺與酶活力的大小成正比。二、實(shí)驗(yàn)儀器試管7220分光光度計(jì)恒溫水浴鍋三、實(shí)驗(yàn)試劑1. 福林試劑B：見福林(Folin)-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度部分(冰箱中)2. 0.55mol/L碳酸鈉溶液：58.3g無水碳酸鈉溶于蒸餾水，稀釋并定容至1000ml3. 10%三氯乙酸溶液4. 0. 2mol/L磷酸緩沖

2、液(pH7.5)：5. 0.5% 酪素溶液：稱取0.5g酪素，以0.5mol/L氫氧化鈉1ml濕潤(rùn)，再加少量0. 2mol/L磷酸緩沖液稀釋。在水浴中煮沸溶解，冷卻，稀釋并容至100ml，冷藏在(冰箱)里。6. 500ug/L酪氨酸溶液7. 胰蛋白酶溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟v 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：按下表加入試劑：管號(hào)123456500ug/L酪氨酸溶液00.20.40.60.81.0蒸餾水1.00.80.60.40.20v 各管中加0.5%酪素2ml，于37水浴中反應(yīng)15分鐘，然后加入10%三氯乙酸3ml，過濾除去沉淀，取清液1ml，加入0.55mol/L碳酸鈉5ml，再加入福林試劑1ml，于37 水浴中

3、顯色15分鐘，測(cè)OD680。v 以光密度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的微克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取干燥的試管2支，按下表加入試劑管號(hào)12備注0.5%酪素溶液2.02.037水浴中酶解15分鐘0. 2mol/L磷酸緩沖液1.002mg/ml胰酶溶液01.010%三氯乙酸溶液3.03.0過濾上清液1137水浴中顯色15分鐘0.55mol/L碳酸鈉溶液5.05.0福林試劑B11OD68000 管號(hào)1234567（樣品）酪氨酸微克數(shù)00.10.20.30.40.5-OD68000.1560.2520.3730.4990.5840.873OD68000.1580.2530.3740.5010.

4、5850.875OD68000.1590.2550.3750.5030.5860.877OD680(平均)00.158 0.253 0.3740.5010.5850.875五、結(jié)果計(jì)算由上表可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：由上可知，樣品的吸光度y=0.875，則x=0.7336g，即A=0.7336g故根據(jù)公式樣品中含酶活力單位=A/15 FA樣品測(cè)定光密度查曲線得相當(dāng)酪氨酸ug數(shù)F酶液稀釋倍數(shù)胰蛋白酶活力為：0.7336 /15 13=0.6358六、實(shí)驗(yàn)分析1. 測(cè)定胰蛋白酶活力的原理?答：蛋白質(zhì)中含具酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），用胰蛋白酶水解蛋白底物，生成含酚基的氨基酸與福林酚試劑反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在一定的范圍內(nèi)，藍(lán)色化合物顏色的深淺與酶活力的大小成正比。2. 胰蛋白酶的最適PH值多少? PH值對(duì)胰蛋白酶穩(wěn)定性