DNA測序常見問題和分析報告文案

1、測序常見問題與其分析Collected by RobertoRun,12.10.2008(From:HTUTU1、PCR產(chǎn)物測序時出現(xiàn)重疊峰問題圖1（模板中有堿基缺失，往往是單一位點（1-1）或兩個位點（1-2）堿基缺失導(dǎo)致測序結(jié)果移碼）圖1-1圖1-2解決方法：將PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒（如T載體）中挑單克隆測序，或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純化）后再進(jìn)行測序。問題圖2（PCR產(chǎn)物不純，含部分序列一致的兩種以上的片段，長度不一）圖2解決方法：主要原因是PCR產(chǎn)物沒有純化，含有部分序列一致的兩種以上長度不一的片段，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行PAGE純化（至少瓊脂糖充分電泳后切膠純

2、化）后再進(jìn)行測序，便可解決。問題圖3（測序引物有堿基缺失）測序引物有堿基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的堿基缺失即圖1有些類似，所不同的是模板堿基缺失一般是在一段正常測序序列后才出現(xiàn)移碼，而引物堿基缺失的話，則從測序一開始就出現(xiàn)移碼，表面在圖形上便是一開始就是嚴(yán)重的峰形重疊。解決方法：重新合成引物，或?qū)⒁镞M(jìn)行PAGE純化2、克隆測序時出現(xiàn)峰形重疊原因：所挑選的重組子不是單克隆，所提供的測序用質(zhì)粒中含有兩種以上插入片段不同的質(zhì)粒；或是是送測序的菌液污染解決方法：重新挑單克隆的菌落（劃線分離單菌落），提質(zhì)?；蛩途涸俅螠y序。3、樣品有雜合/突變位點模板中有雜合型突變，也就說模板本

3、身在這個位點出現(xiàn)突變；或者是從基因組中擴(kuò)增出來的雜合位點。如果模板有雜合（突變或缺失），那么測序圖形中其他的位點一般都是單一的峰形，然后突然在某一個位點出現(xiàn)重疊峰(如圖中箭頭所示)。解決方法：建議將DNA片段克隆到載體再測序。4、polyA/T和C/Gcluster導(dǎo)致的套峰和測序信號衰減圖4-1圖4-3圖4-4RACE測序時經(jīng)常遇到圖4-1和圖4-4的情形，解決方法：從另一端測序；但如果這樣的序列出現(xiàn)在中間，呵呵，目前還沒有很好的解決方法，要看測序公司的本事了。C/Gcluster在PrV基因組測序時遇到過。后來還是讓TaKaRa公司給解決了，雖然不喜歡鬼子，但有時候卻不得不用它們的產(chǎn)品和服

4、務(wù)。5、基因中含有重復(fù)序列可能的原因:樣品中含有重復(fù)序列導(dǎo)致的測序結(jié)果和PolyA/T的結(jié)果一樣，會導(dǎo)致Frame滑動，較短的重復(fù)序列會導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)移碼；而較長的重復(fù)序列會使定序信號衰減。解決辦法:反向測序有時能夠順利的通過重復(fù)序列區(qū)域(但不是一定都能夠)，通過多次的測序結(jié)果比對，拼接可以得到全序列結(jié)果。TT測序結(jié)果常見的幾個問題TT(From:HTUTU )1 、 為什么開始一段序列的信號很雜亂，幾乎難以辨別?這主要是因為殘存的染料單體造成的干擾峰所致，該干擾峰和正常序列峰重疊在一起；另外，測序電泳開始階段電壓有一個穩(wěn)定期，所以經(jīng)常有20-50 bp 的緊接著引物的片段讀不清楚，有時甚至

5、更長。 2 、 為什么在序列的末端容易產(chǎn)生 N 值，峰圖較雜?由于測序反應(yīng)的信號是逐漸減弱的，所以序列末端的信號會很弱，峰圖自然就會雜亂，加上測序膠的分辨率問題，如果堿基分不開，就會產(chǎn)生 N 值，正常情況下ABI377測序儀能正確讀出500個堿基的有效序列。 3 、 測序結(jié)果怎么找不到我的引物序列?如果找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因為引物本身是不被標(biāo)記的，所以在測序報告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的擴(kuò)增引物，可能是您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到擴(kuò)增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此時需找引物的互補序列。 4 、

6、 測序結(jié)果怎么看不到我克隆的酶切位點?可能的原因同上，您克隆的酶切位點距離您的測序引物太近，開始一段序列很雜，幾乎難以辨別，有可能看不清或看不到酶切位點。通常我們會盡量選擇距離酶切位點遠(yuǎn)點的引物，當(dāng)然，若是樣品出現(xiàn)意外原因，如空載、載體自連等，克隆的酶切位點也是看不到的。 5 、 你測出的結(jié)果與我預(yù)想的不一致，給我的結(jié)果與我需要的序列有差距，這是怎么回事?首先，我們會核實給您的測序結(jié)果是否對應(yīng)您的樣品編號，如果對應(yīng)的是您的樣品，由于不知您的實驗背景，測得的序列是否與您預(yù)想的結(jié)果一致我們無法判斷，我們能做到的是檢查發(fā)送給您的測序結(jié)果和您提供來的樣品是否一致。 6 、 序列圖為什么會有背景噪音(雜

7、帶)?是否會影響測序結(jié)果?序列圖的背景雜帶是由熒光染料引起，如果太強(qiáng)會影響測序結(jié)果，要看信噪比，我們給的結(jié)果信噪比大都在98%以上。 7 、測序 結(jié)果為什么與標(biāo)準(zhǔn)序列有差別？原因可能有： 樣品個體之間的差別、測序準(zhǔn)確率的問題，自動測序儀分析序列的準(zhǔn)確并非100%，建議至少測一次雙向，通過雙向測序可以最大限度減少測序的錯誤。當(dāng)然盡管我們有時做了最大努力，但還是保證不了和文獻(xiàn)序列完全一致，但我們測序報告是客戶樣品序列的真實結(jié)果。 8 、 PCR 產(chǎn)物測序與克隆后測序序列為什么有差別?PCR 產(chǎn)物克隆到載體中進(jìn)行測序，有兩個方面可能序列有變化：首先， PCR 擴(kuò)增過程中可能產(chǎn)生錯配。將片段克隆到載體

8、中也有可能發(fā)生突變；其次，測序的準(zhǔn)確率并非100%。 9 、 有雜合位點，但你們的報告上看不到雜合的信號！如果在您認(rèn)為應(yīng)該出現(xiàn)雜合信號的位置上只出現(xiàn)單一的信號，那么可能是您樣品突變的模板與正常的模板的比例沒達(dá)到可以測出的濃度。測序反應(yīng)的信號強(qiáng)度直接與模板的量有關(guān)，如果突變的模板所占的比例很低，儀器會自動將它作為背景信號了，很難檢測出來。只有當(dāng)測序反應(yīng)體系中正常的和突變的模板量比較接近時，才能較可靠地檢測到突變體的存在。其次，在同一位置，不同堿基的信號強(qiáng)度一般是不一樣的，這樣即使突變的模板所占的比例較高時，也不一定能準(zhǔn)確檢測到突變的存在，因為，測序儀是主要用來測序正常的堿基序列的，軟件分析結(jié)果時

9、，會盡量提高主峰而將背景信號盡量壓低，以得到盡可能好的結(jié)果。尊重結(jié)果，我們是不會人為將出現(xiàn)單一的信號修改為雜合位點的。 10 、 DNA 測序樣品用 TE 溶液溶解好不好?由于 EDTA 是 Taq 聚合酶的一種潛在的抑制物, DNA 的測序反應(yīng)也是 Taq 酶的聚合反應(yīng)，需要一個最佳的酶反應(yīng)條件,因此 DNA 測序樣品溶解時，最好用滅菌水溶解。 11 、 我送什么形式的菌體樣品好?菌體的一般形態(tài)有、菌液，平板培養(yǎng)菌、穿刺培養(yǎng)菌，甘油保存菌等。我們建議客戶所送的形態(tài)以方便且不易受污染為準(zhǔn)則，推薦穿刺培養(yǎng)菌。 客戶用過夜培養(yǎng)好的菌液2 ml 。 12 、 為什么你們給我的序列是反的?測出來的結(jié)果

10、與您預(yù)期的方向并不一致,可能是片斷插入方向是非定向的，這在 PCR 產(chǎn)物 T/A 克隆中較常見。有時，客戶要求的測序引物離克隆位點較近，如果反向引物相對克隆位點較遠(yuǎn)，為得到更好的結(jié)果，我們會選擇反向引物測序，若是這種情況，用看圖軟件 Chromas 可以把圖反轉(zhuǎn)過來，就可得到正向序列。 13 、 Template mixed 為何種情況?測序結(jié)果表現(xiàn)為套峰，測序反應(yīng)信號很好，測序結(jié)果雜亂,即同一個位置有二個峰。原因可能有：樣品并非單一模板、 PCR 產(chǎn)物中有雜帶、質(zhì)粒為雙克隆產(chǎn)物、引物特異性不高，有兩個結(jié)合點， PCR 產(chǎn)物電泳時看不出，但測序結(jié)果能清楚地說明這點。 14 、 polyT 或

11、polyA 后峰圖雜，怎么也要收費?這種情況一般表現(xiàn)為 A 、 T 連續(xù)結(jié)構(gòu)后面的測序結(jié)果出現(xiàn)套峰，是樣品的在原因。這類問題我們應(yīng)該同正常測序一樣，給客戶報告，反應(yīng)按正常收費。 15 、 我的引物做 PCR 條帶很好，但為什么測不出序來？并不是能做 PCR 反應(yīng)的引物都能測序，測序所用引物要求較高,必須與模板完全匹配（有時 5' 端可以有個別堿基的簡并），引物長度一般為20個堿基左右、 GC 含量適中，而且用于測序的引物一定要足夠純。 16 、如果 我的菌種培養(yǎng)得很好，測序應(yīng)該不會有問題吧?對于宿主菌，提倡使用宿主菌 DH5 ， DH1 、 和 C600 E.coli 菌株也可， XL

12、1-Blue E.coli 菌株也不錯，但其生長過慢。 JM 系列、 TG1 系列和 HB101 系列 E.coli 菌株等由于產(chǎn)生大量的碳水化合物（即糖），而應(yīng)當(dāng)盡量避免使用；其它宿主菌可能會對測序造成影響。 17 、 為什么 G/C rich 的樣品沒結(jié)果或結(jié)果不好，照常收費?由于 G/C 連續(xù)結(jié)構(gòu)有時會造成反應(yīng)中途無常進(jìn)行，如果結(jié)構(gòu)在引物下游近處，反應(yīng)只有一小段的信號，有時甚至反應(yīng)根本沒信號。對于這種情況，本身就潛在不確定性的測序，有很大的失敗因素。 18 、 PCR 產(chǎn)物150 bp 以下的為什么不適于直接測序?PCR 產(chǎn)物 150bp 以下的純化和定量都有一定困難，用于測序的 PCR

13、 產(chǎn)物一般不低于150 bp 長度。一個150 bp 的 PCR 產(chǎn)物用于測序，去掉兩個引物的序列大約40到50 bp ， 再加上測序起始端的一些讀不好的堿基，真正能夠得到的有用序列不過幾十堿基。這只是最理想的假設(shè)，這么短片斷測序失敗的幾率非常大，因此只能克隆后再進(jìn)行測序。 19 、 我的質(zhì)粒樣品很好，測序結(jié)果怎不好?由于原因不明的復(fù)雜結(jié)構(gòu)如發(fā)卡和回文結(jié)構(gòu)，有時會出現(xiàn)突然信號減弱或消失；有時測序根本不能進(jìn)行下去， DNA 堿基排列并無特別異常，可能是 DNA 整體出現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)，反應(yīng)無法進(jìn)行。 20 、 我的樣品還保留了嗎?我想現(xiàn)在反向再測一個反應(yīng)。出于原則我們測序樣品只保留一個月，所以若要再測

14、序，請抓緊時間，否則只有重新送樣。 21 、 已經(jīng)測通了樣品，但重疊的地方有錯配，是為什么?測通的全序列是拼接后的結(jié)果，由于拼接處一般是在一次測序的末端和次個反應(yīng)開始一段，通常會有一定的雜帶，以序列信號好的為主，次的為參考，但也不絕對。 常見峰圖與原因說明(From: HTUTU )1.PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測序結(jié)果說模板雜？2. 什么是堿基缺失？3. 什么是引物不純？4. 重復(fù)結(jié)構(gòu)對測序有哪些影響？5. 什么是模板不單一？6. Poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果是怎樣的？7. 含有回文結(jié)構(gòu)的模板測序結(jié)果是怎樣的？8. 測序峰圖為前雙峰的結(jié)果是什么樣的？9. 測序峰圖為后雙峰是什么樣的？10.

15、 無信號的結(jié)果：信號值(ATGC的平均值)皆小于10011. 飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時堿基產(chǎn)生替代而出現(xiàn)堿基位移12. 沒有任何干擾的結(jié)果Q-1.PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測序結(jié)果說模板雜？A-1.PCR產(chǎn)物電泳檢測的結(jié)果只是一個粗略的定性結(jié)果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是無法用肉眼區(qū)分開的。但是DNA測序反應(yīng)敏感而客觀，可以直接反應(yīng)出模板本身的情況。需要強(qiáng)調(diào)的是，高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物才可能得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，如果您對PCR產(chǎn)物的純度不很確定，希望您可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，以確保得到好的測序結(jié)果。以下圖為例：該反應(yīng)的背景信號較高，不利于

16、堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴(kuò)增?；蛘呖梢詫⒃揚CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測序。Q-2.什么是堿基缺失？A-2.以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中擴(kuò)增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個連續(xù)的T解決方法： (1) 使用反向引物繼續(xù)測序，以矯正缺失位點并達(dá)到測通的目的。或者將該PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，挑取單克隆測序。 (2) 如果可以確定該PCR片段中不應(yīng)該有缺失的位點，那么可以改變PCR反應(yīng)條件，重新擴(kuò)增。Q-3.什么是引物不純？A-3.以下圖為例：引物不純造成移碼現(xiàn)象，該種現(xiàn)象與模板雜在峰圖都表現(xiàn)為背景峰較雜，但是引物不純在峰圖上表現(xiàn)的

17、更有規(guī)律，一般在每一個主峰前或者后都有一個同一堿基的小峰。解決辦法：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測序。Q-4.重復(fù)結(jié)構(gòu)對測序有哪些影響？A-4.以下圖為例：重復(fù)結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致測序復(fù)制框的滑移，重復(fù)結(jié)構(gòu)之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該重復(fù)結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q-5.什么是模板不單一？A-5.以下圖為例：(1) 菌液為非單克?。?下圖是pGEM-T載體測序的結(jié)果，在83位點處測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰（插入后雙峰），即模板中含有兩個或兩個以上的一樣載體，但是插入片段不同。 解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切

18、鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。(2) PCR產(chǎn)物不純，如下圖所示：在197bp前測序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，這個A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。 注：PCR產(chǎn)物測序都是以A高峰終止。 解決方法：對PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測序。Q-6.Poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果是怎樣的？A-6.以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼、雙峰、套峰現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導(dǎo)致測序信號的衰減或者直接中斷。 解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。

19、如果是較長的PloyG/C，建議客戶使用3.0試劑盒進(jìn)行測序。Q-7.含有回文結(jié)構(gòu)的模板測序結(jié)果是怎樣的？A-7.以下圖為例：位點94至137是一個回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號衰減，出現(xiàn)錯誤的判讀。 解決方法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。A-8.測序峰圖為前雙峰的結(jié)果是什么樣的？A-8. (1) 產(chǎn)物中含有小片段PCR產(chǎn)物；(2) 引物有兩個結(jié)合位點，其中一個結(jié)果中斷解決方法：換引物反向測序。Q-9.測序峰圖為后雙峰是什么樣的？A-9.原因和解決方法同回文結(jié)構(gòu)與插入后雙峰。Q-10.無信號的結(jié)果：信號值（ATGC的平均值）皆小于100A-10.以下圖

20、為例：測序無信號的判定： 在確認(rèn)引物、質(zhì)粒抽提濃度、反應(yīng)安排等條件無問題的情況下，測序結(jié)果峰型雜亂且信號值小于100的結(jié)果；此時則判定結(jié)果為測序無信號。兩次測序無信號，我們會取消實驗。Q-11.飄峰：這是由于用3.0特殊試劑盒時堿基產(chǎn)生替代而出現(xiàn)堿基位移A-11.以下圖為例在用特殊試劑盒（3.0）時，會發(fā)生堿基替代，從而出現(xiàn)堿基位移的現(xiàn)象，即飄峰。 解決方法：用普通試劑盒（3.1）測序消除堿基位移。 注：3.0試劑盒只對局部高GC有效，對POlyA/T、重復(fù)結(jié)構(gòu)（GT/GA等）無效，建議先用3.0試劑盒測序，然后用普通試劑盒進(jìn)行糾正。Q-12.沒有任何干擾的結(jié)果A-12.DNA 測序常見問題解

21、答（FAQs）(From : HTUTU sinogenomax./cs-zonecontent.aspx?Column_ID=109UUTTH )DNA 測序常見問題解答（FAQs）Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準(zhǔn)確度如何？Q2. 為什么在測序報告上找不到我的引物序列？ Q3. 我有一個大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。 Q4. 為什么我的PCR片段為300bp，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？ Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結(jié)果？ Q6. 我進(jìn)行PCR反應(yīng)時，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度

22、對我的樣品完成測序反應(yīng)？ Q7. 我的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有多條帶，是否可以為我完成切膠純化，再進(jìn)行測序反應(yīng)？哪些情況下需要進(jìn)行切膠純化？ Q8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測序？ Q9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測序結(jié)果說模板雜？ Q10. 什么是堿基缺失？ Q11. 什么是引物不純？ Q12. 重復(fù)結(jié)構(gòu)對測序有哪些影響？ Q13. 什么是模板不單一？ Q14. poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果是怎樣的？ Q15. 含有回文結(jié)構(gòu)的模板測序結(jié)果是怎樣的？Q1. DNA測序的原理是什么？步驟如何？ABI 3730XL型測序儀測序的準(zhǔn)確度如何？答：DNA測序的原

23、理是末端終止法。具體步驟如下：        定量：對樣品與引物進(jìn)行定量。        測序反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入已定量的模板和引物，BigDye等試劑，PCR儀上完成測序反應(yīng)。        讀取數(shù)據(jù)：利用測序儀讀取被測樣品的堿基序列。        ABI公司目前承諾測序結(jié)果在800

24、bp以準(zhǔn)確率為98.5%。Q2. 為什么在測序報告上找不到我的引物序列？答：1） 如果您提供的是PCR樣品，在測序報告上找不到您的引物序列是正常的。這是因為測序反應(yīng)是通過對被熒光標(biāo)記的ddNTP的讀取而獲得基因序列的，而測序引物由于沒 有熒光標(biāo)記，因此自然在測序結(jié)果中就不會被識別。實際上不但測序引物無法識別，而且由于目前測序技術(shù)的局限性，緊靠測序引物一側(cè)的3050個bp通常也無法100識別，如果需要驗證這個區(qū)域的堿基序列或者測序引物本身的序列，就需要用另一側(cè)引物進(jìn)行反向測序。2 ）您提供的是質(zhì)?；蚓簶悠?使用通用引物測序，找不到您的PCR引物可能是因為您的PCR引物距離載體的通用引物位點過近

25、，由于測序反應(yīng)在距離起始位點30-50bp的結(jié)果可信度不高，因此會影響您正確讀取您的PCR引物序列。Q3.我有一個大于2KB的PCR片段，希望你們幫我測通。答：對于片段較大的PCR樣品我們建議您將其克隆進(jìn)載體后再做測序。因為，一方面PCR產(chǎn)物的純度不是很好掌握，測序的成功率不如質(zhì)粒和菌液測序；另一方面，與PCR引物相比，一般載體上的通用引物與模板結(jié)合的能力更強(qiáng)。長度為1Kb的DNA模板需要兩個測序反應(yīng)，才有可能得到完整準(zhǔn)確的讀長，對于1kb以上的DNA片斷，在兩個反應(yīng)后還需要設(shè)計合成測序引物，測序后拼接出全長，對于這些測序引物，我們將按堿基個數(shù)收取引物合成費用。Q4.為什么我的PCR片段為30

26、0bp，而你們發(fā)送給我的序列卻達(dá)到了700多bp？答：如果您查看峰圖的話，可以在您的PCR序列終止處看到一個高高的A峰，該A峰是您的PCR測序反應(yīng)的結(jié)束標(biāo)志，在此標(biāo)志之后的序列是噪音，而不是您的測序結(jié)果。因為我公司完全忠實于測序結(jié)果，不會對測序結(jié)果進(jìn)行人為修改。所以在您收到結(jié)果時，請結(jié)合我們的DNA測序服務(wù)報告查看測序峰圖，按照您的實驗要求對測序結(jié)果進(jìn)行分析。Q5. 我的引物做PCR效果很好，為什么用于測序總得不到好的結(jié)果？答：用于測序的引物比用作PCR反應(yīng)的引物要求高，以下是不適合用于測序反應(yīng)的引物類型：        不

27、純的引物：用于測序的引物純度要求很高，合成中的小片段會直接造成嚴(yán)重的背景峰。用于測序的引物序列長度之所以一般在24個堿基之，就是因為過長的引物純度不易保證。        簡并引物，隨機(jī)引物和有特殊標(biāo)記的引物都不適合DNA測序。Q6. 我進(jìn)行PCR反應(yīng)時，所用的退火溫度是59，是否可以用該溫度對我的樣品完成測序反應(yīng)？答：非常抱歉，目前我公司不會單獨對客戶的測序反應(yīng)設(shè)定特定的條件，全部的測序反應(yīng)均在統(tǒng)一的條件下完成。Q7. 我的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物有多條帶，是否可以為我完成切膠純化，再進(jìn)行測序反應(yīng)？哪些情況下需要進(jìn)行切膠純化。答：目

28、前我公司通常只接收單一條帶的PCR產(chǎn)物，一般不提供切膠純化服務(wù)。如果老師自己實驗室的確無法完成切膠工作，在同意交付25元/條帶的服務(wù)費后，我公司可以提供此項服務(wù)。PCR產(chǎn)物電泳檢測后發(fā)現(xiàn)以下情況之一時，建議進(jìn)行切膠純化：1） 除主帶外，還存在其他條帶；2） 引物二聚體在過柱純化后還大量存在，將影響測序結(jié)果；3）體系中鹽分在過柱純化后還影響測序結(jié)果。Q8. 我的PCR產(chǎn)物為單一條帶，但未經(jīng)純化，是否可以直接送到貴公司進(jìn)行測序？答：可以。我公司將免費為您進(jìn)行PCR產(chǎn)物的過柱純化，目的在于去除PCR反應(yīng)體系中的大部分小片段、剩余dNTP與大部分的鹽分。Q9. 我的PCR產(chǎn)物電泳檢測條帶單一，為什么測

29、序結(jié)果說模板雜？答：PCR產(chǎn)物電泳檢測的結(jié)果只是一個粗略的定性結(jié)果。對于與目的片段條帶大小只相差幾個堿基的非特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是無法用肉眼區(qū)分開的。但是DNA測序反應(yīng)敏感而客觀，可以直接反應(yīng)出模板本身的情況。需要強(qiáng)調(diào)的是，高質(zhì)量的PCR產(chǎn)物才可能得到高質(zhì)量的測序結(jié)果，如果您對PCR產(chǎn)物的純度不很確定，希望您可以將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆處理，以確保得到好的測序結(jié)果。以下圖為例：該反應(yīng)的背景信號較高，不利于堿基的判讀。解決辦法：改變PCR條件，重新擴(kuò)增。或者可以將該PCR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，初步篩選后進(jìn)行單克隆測序。Q10.什么是堿基缺失？答：以下圖為例：堿基缺失常見在PCR產(chǎn)物中，特別是從基因組中擴(kuò)

30、增得到的PCR片段，上圖的186位缺失兩個連續(xù)的T。解決方法：1) 使用反向引物繼續(xù)測序，以矯正缺失位點并達(dá)到測通的目的?；蛘邔⒃揚CR產(chǎn)物克隆到質(zhì)粒中，挑取單克隆測序；2) 如果可以確定該PCR片段中不應(yīng)該有缺失的位點，那么可以改變PCR反應(yīng)條件，重新擴(kuò)增。Q11.什么是引物不純？答：以下圖為例：引物不純造成移碼現(xiàn)象，該種現(xiàn)象與模板雜在峰圖都表現(xiàn)為背景峰較雜，但是引物不純在峰圖上表現(xiàn)的更有規(guī)律，一般在每一個主峰前或者后都有一個同一堿基的小峰。解決方法：重新合成引物，或者將引物進(jìn)行PAGE純化后再進(jìn)行測序。Q12.重復(fù)結(jié)構(gòu)對測序有哪些影響？答：以下圖為例：重復(fù)結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致測序復(fù)制框的滑移，重復(fù)結(jié)

31、構(gòu)之后峰型混亂。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該重復(fù)結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q13.什么是模板不單一？答：以下圖為例，下圖是pGEM-T載體測序的結(jié)果，在83位點處測序結(jié)果出現(xiàn)雙峰，即模板中含有兩個或兩個以上的一樣載體，但是插入片段不同。解決辦法：重新挑取單克隆或者重新提取質(zhì)粒。需要注意的是，重新進(jìn)行PCR反應(yīng)或者酶切鑒定僅能證明該克隆含有插入片段，并不足以證明模板的單一。對于PCR產(chǎn)物也同樣有模板不單一的情況，如下圖所示：在197bp前測序峰表現(xiàn)為雜或有明顯套峰，且在197bp位置有一個高高的A峰，這個A峰標(biāo)志著此PCR產(chǎn)物中有一個片段大小為200bp左右的小片段。解決方

32、法：對PCR產(chǎn)物切膠純化，再進(jìn)行測序。Q14. poly結(jié)構(gòu)的測序結(jié)果是怎樣的？答：以下圖為例：以polyT為例，在polyA/T結(jié)構(gòu)之后往往出現(xiàn)移碼現(xiàn)象，而在polyG/C之后會往往導(dǎo)致測序信號的衰減。解決辦法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該poly結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。Q15.含有回文結(jié)構(gòu)的模板測序結(jié)果是怎樣的？答：以下圖為例：位點94至137是一個回文結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后面的信號衰減，出現(xiàn)錯誤的判讀。解決方法：使用反向引物對模板進(jìn)行測序，測到該回文結(jié)構(gòu)處，即可完成模板全長的拼接。手把手教您看測序圖(From: HTUTU )一般來說，我們只需把測序序列結(jié)果和原有的目的序列結(jié)果

33、進(jìn)行比對（Blast）就行了，如果序列百分之百吻合，或者所需要的突變點（片段）成功突變或插入片段成功插入，就OVER了。關(guān)鍵是測序結(jié)果有時候模憐兩可，需要我們自己來把握，或者說，為我們自己爭取不付費的權(quán)利。測序看圖文件有吧？沒有就下載這個：點擊瀏覽該文件里面有個補丁，打一下，就可以永久使用了。測序結(jié)果文件一般有兩個，一個是序列文件，一個是圖譜文件，圖譜文件用上面的程序可以打開（*.abi.或 *.scf)。序列文件打不開？那您能隨便裝個什么DNAstar,DNAman或者俺最喜歡用的Genetool，或者裝個edit（這玩意好啊，一般人沒用過，呵呵）1.安裝好看圖軟件后，雙擊峰圖文件就可以打開

34、，沒有序列文件？那下一個吧：點擊瀏覽該文件 打開峰圖文件，依據(jù)圖形初步判定測序質(zhì)量，這個圖一般般，頭峰雜度比較大，至少前50bp序列不可信。2. 既然峰形不錯由此初步判定測序結(jié)果可信，那就來比比測序結(jié)果與我們預(yù)期的有什么差異吧. 當(dāng)我們打開圖形文件的時候，我們也可以輸出測出來的序列，就是export啦，如下圖，port后能得到文本形式的序列結(jié)果不過俺一般習(xí)慣了用ultra-edit，直接雙擊測序公司提供的序列文件，它是這樣顯示的：我說，您還是別用了，俺當(dāng)初是用ultra-edit處理一些其它數(shù)據(jù)（當(dāng)然是word/notebook等無法勝任的數(shù)據(jù)）時，發(fā)現(xiàn)它還可以打開*.seq文件，于是就一直用

35、過來了3.關(guān)于序列比對，沒有太多好說的吧。假設(shè)原有序列為A文件，測序結(jié)果為B文件，例如，在DNA工具軟件genetool中打開B，通過調(diào)用工具（上圖），進(jìn)入Blast程序(說這個是Blast程序有點牽強(qiáng)，其實是同源性比較，其實質(zhì)不就是Blast的嘛，哈哈)。加上原序列文件A之后，就直接按align all button啦這個就是比對結(jié)果：4、峰圖頭尾測序結(jié)果的不可靠性：頭尾的問題，很多測序公司都明確標(biāo)出了頭尾各80-100bp序列的不可靠性，這是測序起始信號與終止信號不穩(wěn)定的體現(xiàn)，就如同一個跑步一樣，發(fā)力起跑與力衰止跑之時，速度是不穩(wěn)定的，無法用來衡量其跑步速度.但俺見識過一家測序公司的測序結(jié)

36、果，既使是頭尾區(qū)，其結(jié)果也是可信的，但總體測序長度不夠長，可能是用其它軟件進(jìn)行了掐頭去尾之后移花接木的處理吧！這里要強(qiáng)調(diào)一點的是，有時候測序公司給出的是反向測序結(jié)果，簡單的align得不到匹配結(jié)果，這時，你千萬不要急著罵測序公司，試試把測序結(jié)果reverse 或reverse complement一下再進(jìn)行align，也許會有預(yù)期的結(jié)果(見過不少這樣的朋友，其實仍然只能怪我們自己_)5.干擾峰與結(jié)果判讀這個峰是作出來的，線條有點粗，將就說事。第一個峰，重疊干擾。如果不判讀為干擾峰，那就說明樣品不純，如果是基因組DNA，就很好地說明了樣品為雜合子，該位點可能存在SNP現(xiàn)象（T/G）。如果判讀為干擾峰，我們只需認(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。第二個峰，錯位干擾。如果不判讀為干擾峰，則說明樣本可能比預(yù)期多一個堿基（G），如果判讀為干擾峰，我們?nèi)灾恍枵J(rèn)定樣品此處堿基為T為行了。所謂干擾，前提前件是主峰要清晰、連續(xù)，但峰圖中莫名其妙多出一條類似或接近于主峰清晰程度的峰線，但這種峰線往往是不平滑、不連續(xù)的，這是干擾峰判讀的重點！6、SNP的判讀做SNP的人不少，AFLP仍然是一種經(jīng)濟(jì)、適用的方法之一。AFLP的結(jié)果多需要用測序來進(jìn)行驗證，但似乎以測序來驗證結(jié)果的人并不多，或者說驗證一二個樣本就完了，其實這樣并不科學(xué)，還是多驗證幾個吧，證據(jù)多了