分光光度法α-半乳糖苷酶活力測定

1、分光光度法-半乳糖苷酶活力測定A.1 -半乳糖苷酶活力測定A.1.1 定義：在pH5.5并37條件下，每分鐘內(nèi)從10mmol/L對硝基酚-D-吡喃半乳糖中降解釋放1mol對硝基酚所需要的酶量為一個酶活單位U。A.1.2 原理：-半乳糖苷酶能將對硝基酚-D-吡喃半乳糖降解成對硝基酚。通過400nm比色測定釋放的對硝基酚的量，可以計算反應液中-半乳糖苷酶的活力。A.1.3 試劑、溶液A.1.3.1 醋酸鈉緩沖液，濃度c（CH3COONa）為0.05 mol/L，pH值為5.5：A液：稱取無水醋酸鈉4.2g定容至1000mL；B液：冰醋酸3.0 mL定容至1000 mL。用B液調(diào)節(jié)A液至pH5.5。

2、A.1.3.2 碳酸鈉溶液，濃度c（NaCO3）為0.2mol/L：準確稱取21.198g無水碳酸鈉，定容至1000mL。A.1.3.3 對硝基酚標準溶液，濃度c 為10 mmol/ L：稱取0. 1391 g 對硝基苯酚，精確到0. 001 g ,用碳酸鈉溶液定容至100 mL，低溫保存。依次移取對硝基苯酚標準貯備液1 mL 、2 mL 、3 mL 、4 mL 、5 mL 、7 mL 、9 mL ,用碳酸鈉溶液定容至100 mL ,配成濃度為0.1 mmol/ L 、0.2 mmol/ L 、0.3mmol/ L 、0.4mmol/ L 、0.5mmol/ L 、0.7mmol/ L 、0.

3、9mmol/ L 的對硝基苯酚標準工作液。A.1.3.4 對硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液，濃度c 為10mmol/L：稱取3.031g對硝基酚-D-吡喃半乳糖，用醋酸鈉緩沖液定容至1000mL，置棕色試劑瓶于4 以下保存。 A.1.4 儀器、設備 A.1.4.1 實驗室用樣品粉碎機或碾缽。A.1.4.2 分樣篩：孔徑為0.25 mm（60目）。A.1.4.3 分析天平：感量0.001 g。A.1.4.4 pH計：精確至0.01。A.1.4.5 磁力攪拌器：附加熱功能。A.1.4.6 電磁振蕩器。A.1.4.7 燒結玻璃過濾器：孔徑為0.45 mm。A.1.4.8 離心機：2000 r/min。A

4、.1.4.9 恒溫水浴鍋：溫度控制范圍在3060之間，精度為0.1。A.1.4.10 秒表：每小時誤差不超過5s。A.1.4.11 分光光度計：能檢測350800nm的吸光度范圍。A.1.5 分析步驟A.1.5.1 標準曲線的制作吸取1mL對對硝基酚標準溶液（A.1.3.3）于試管中，加入1mL醋酸鈉緩沖液(A.1.3.1)；對照的空白試管中加入2mL醋酸鈉緩沖液（A.1.3.1)；在所有的試管中加入8mL碳酸鈉溶液(A.1.3.2)，振蕩，在400nm處測定吸光度OD值。以對硝基酚濃度為Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。A.1.5.2 試樣溶液的處理固體樣品應粉碎或充分碾碎，然后過60

5、目篩（孔徑為0.25 mm），稱取固體樣品1g左右，用80mL醋酸鈉緩沖液(A.1.3.1)浸泡，磁力攪拌30分鐘，用醋酸鈉緩沖液(A.1.3.1)定容至100mL，用Whatman No.1濾紙過濾。液體試樣可以直接用醋酸鈉緩沖液(A.1.3.1)進行稀釋和定容。當酶液的酶活在20U/L以內(nèi)，測試結果較準確。A.1.5.3 測定步驟將上述稀釋酶液（A.1.5.2）和底物對硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液（A.1.3.4）于37下振蕩10分鐘預熱。然后再吸取各溶液0.1mL，充分混合，于37恒溫振蕩10分鐘，加入0.8mL碳酸鈉溶液(A.1.3.2)，振蕩混勻，終止酶反應，以蒸餾水調(diào)零，在400nm處測定吸光度OD值。酶液空白用經(jīng)過預熱的酶液各0.1mL，然后加入0.8mL碳酸鈉溶液(A.1.3.2)，振蕩混勻，再各加入0.1mL預熱的底物對硝基酚-D-吡喃半乳糖溶液（A.1.3.4）于37振蕩10分鐘，在400nm處測定吸光度OD值。A.1.6 計算M × t(Ax-Ao×K+Co)×DfX =式中：Ax樣品酶液的吸光度OD值；Ao對應酶液的空白吸光度OD值；K對硝基酚的標準曲線的斜率；Co對硝基酚的標準曲的截距；Df稀釋倍數(shù)；M稱取酶制劑的質(zhì)量