甲殼質(zhì)套管聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷修復(fù)的作用

1、甲殼質(zhì)套管聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)脊髓損傷修復(fù)的作用 阿麗婭，宋有鑫，姜保國(guó)阿麗婭，宋有鑫，姜保國(guó) 北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 基金支持：國(guó)家基金支持：國(guó)家973重大基礎(chǔ)研究項(xiàng)目重大基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2003CB515306)背景介紹背景介紹中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷危害傳統(tǒng)脊髓損傷的治療策略傳統(tǒng)脊髓損傷的治療策略組織工程再生醫(yī)學(xué)概念組織工程再生醫(yī)學(xué)概念支架材料支架材料 + 種子細(xì)胞（生長(zhǎng)因子種子細(xì)胞（生長(zhǎng)因子）支架材料的研究趨勢(shì)支架材料的研究趨勢(shì) 天然支架材料天然支架材料 人工合成不可降解支架材料人工合成不可降解支架材料 人工合成生物可降解支架材料人工合成生物可降解

2、支架材料甲殼質(zhì)套管甲殼質(zhì)套管 中空?qǐng)A柱形套管中空?qǐng)A柱形套管( (北京大學(xué)人民醫(yī)院與中國(guó)紡織科學(xué)院共同發(fā)明，專(zhuān)北京大學(xué)人民醫(yī)院與中國(guó)紡織科學(xué)院共同發(fā)明，專(zhuān)利號(hào)利號(hào):01136314.2),:01136314.2),套管尺寸套管尺寸: :壁厚壁厚0.1mm,0.1mm,內(nèi)徑內(nèi)徑 1.5mm1.5mm。 是一種天然高分子聚合物是一種天然高分子聚合物, ,學(xué)名為學(xué)名為(1 ,4)-2-(1 ,4)-2-乙酰氨基乙酰氨基-2-2-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖 。甲殼質(zhì)來(lái)源于天然海洋生物生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì)。甲殼質(zhì)來(lái)源于天然海洋生物生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì), ,可被體內(nèi)的酶分可被體內(nèi)的酶分解而吸收解而吸收, ,具有良好

3、的吸濕性、紡絲性和成膜性。具有良好的吸濕性、紡絲性和成膜性。生物學(xué)特性生物學(xué)特性 對(duì)生物體無(wú)毒性和炎癥反應(yīng)對(duì)生物體無(wú)毒性和炎癥反應(yīng) 易于在體內(nèi)降解吸收易于在體內(nèi)降解吸收 降解吸收周期適宜，可人為調(diào)控降解吸收周期適宜，可人為調(diào)控 前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí) “甲殼質(zhì)套管能夠促進(jìn)損傷甲殼質(zhì)套管能夠促進(jìn)損傷 后的周?chē)窠?jīng)再生后的周?chē)窠?jīng)再生 ” 種子細(xì)胞種子細(xì)胞 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞 雪旺氏細(xì)胞雪旺氏細(xì)胞 嗅鞘細(xì)胞嗅鞘細(xì)胞 目的：初步探討對(duì)脊髓損傷修復(fù)是否有影響目的：初步探討對(duì)脊髓損傷修復(fù)是否有影響 甲殼質(zhì)套管甲殼質(zhì)套管 + 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 一一

4、、 材料和方法材料和方法-材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備甲殼質(zhì)套管：無(wú)菌甲殼質(zhì)套管：無(wú)菌 3-4mm骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSCs)體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 品系：雄性小鼠品系：雄性小鼠C57BL，表達(dá)綠色熒光蛋白，表達(dá)綠色熒光蛋白 體重：體重：20g20g2 2 取材：股骨取材：股骨、脛骨、髂骨、脛骨、髂骨 換液培養(yǎng)，取傳代后第換液培養(yǎng)，取傳代后第3 3代細(xì)胞移植（代細(xì)胞移植（異種移植異種移植） defabc第三代第三代三種形態(tài)三種形態(tài)a-c MSCs傳代后的第傳代后的第3代；代；d-f MSCs的三種形態(tài)；的三種形態(tài)； a,d MSCs自發(fā)熒光；自發(fā)熒

5、光；b,e 透透射光照射圖像；射光照射圖像；c,f 前兩圖的疊加效果前兩圖的疊加效果. 藍(lán)紅黃箭頭：多角形，扁平不規(guī)則形，藍(lán)紅黃箭頭：多角形，扁平不規(guī)則形，紡錘形紡錘形實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 70只雄性只雄性SD大鼠，體重約大鼠，體重約30025g 動(dòng)物模型為脊髓右側(cè)半橫斷傷，隨機(jī)分動(dòng)物模型為脊髓右側(cè)半橫斷傷，隨機(jī)分4組組,每組每組20只（除正常只（除正常組）組）u正常組正常組：10只只對(duì)照組：?jiǎn)渭儼肭袚p傷模型，不予任何治療；對(duì)照組：?jiǎn)渭儼肭袚p傷模型，不予任何治療；甲殼質(zhì)套管治療組：半切損傷后套管植入治療；甲殼質(zhì)套管治療組：半切損傷后套管植入治療；甲殼質(zhì)套管聯(lián)合甲殼質(zhì)套管聯(lián)合 MSCs組組: 半切損

6、傷后套管植入半切損傷后套管植入,移植細(xì)胞；移植細(xì)胞； 取材時(shí)間點(diǎn)取材時(shí)間點(diǎn): 2w,4w,8w,14w,長(zhǎng)期組（長(zhǎng)期組（ 組）組） 1d,5d,7d,4w,8w（組）組）脊髓半切損傷動(dòng)物模型制作流程脊髓半切損傷動(dòng)物模型制作流程-方法和評(píng)估指標(biāo)方法和評(píng)估指標(biāo)1 1 套管內(nèi)套管內(nèi)脊髓損傷位點(diǎn)脊髓損傷位點(diǎn)組織學(xué)觀察組織學(xué)觀察1.1 脊髓空洞脊髓空洞（免疫組化（免疫組化-HE染色）染色） 8w時(shí)組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，時(shí)組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色染色1.2 膠質(zhì)瘢痕膠質(zhì)瘢痕（免疫熒光（免疫熒光-檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞，GFAP染色）染色） 2w/8w組織固定組織固

7、定-再后固定，包埋，冰凍切片，丙酮固再后固定，包埋，冰凍切片，丙酮固 定后洗片封閉，分別加入抗大鼠定后洗片封閉，分別加入抗大鼠GFAP蛋白一抗和相應(yīng)二抗蛋白一抗和相應(yīng)二抗 1.3 軸突軸突（透射電鏡（透射電鏡- 2W和和14W時(shí)檢測(cè)超微結(jié)構(gòu)）時(shí)檢測(cè)超微結(jié)構(gòu)） 戊二醛固定，后固定，脫水包埋，切片，復(fù)染后觀察戊二醛固定，后固定，脫水包埋，切片，復(fù)染后觀察 2. 2. 檢測(cè)檢測(cè)神經(jīng)纖維是否穿越損傷位點(diǎn)神經(jīng)纖維是否穿越損傷位點(diǎn)2.1 神經(jīng)逆行性示蹤：神經(jīng)逆行性示蹤：對(duì)照組、套管組分別在2周、14周于損傷位點(diǎn)遠(yuǎn)端注 射10%BDA, 多點(diǎn)注射，10天后取大腦和脊髓，脊髓分為近段、遠(yuǎn)段和損傷段，染色顯影，

8、陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)2.2 功能學(xué)評(píng)價(jià)功能學(xué)評(píng)價(jià)：BBB功能評(píng)分；知覺(jué)功能評(píng)分，分別在術(shù)后1w，2w，4w，6w， 8w，10w，12w, 14w檢測(cè)3. 3. 檢測(cè)檢測(cè)MSCsMSCs在套管內(nèi)的生長(zhǎng)情況在套管內(nèi)的生長(zhǎng)情況： 激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡觀察是否增殖、遷移，分別在1d，5d，7d，4w，8w檢測(cè)二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 1 脊髓損傷位點(diǎn)組織學(xué)觀察脊髓損傷位點(diǎn)組織學(xué)觀察 AB套管組術(shù)中和術(shù)后大體形態(tài)觀察套管組術(shù)中和術(shù)后大體形態(tài)觀察A:建立脊髓半橫斷模型后套管縫合建立脊髓半橫斷模型后套管縫合(4x)；B：6個(gè)月后損傷脊髓套管縫合的外觀（個(gè)月后損傷脊髓套管縫合的外觀（4x） 1.1 1

9、.1 脊髓空洞（脊髓空洞（8W8W） CAB脊髓損傷位點(diǎn)免疫組化染色脊髓損傷位點(diǎn)免疫組化染色A：套管組：套管組(100 x)， B：MSCs移植組移植組(100 x)；C：對(duì)照組（：對(duì)照組（100 x），均為），均為8W 1.2 1.2 膠質(zhì)瘢痕（膠質(zhì)瘢痕（2W2W） 脊髓半橫斷后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化脊髓半橫斷后星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化A，B套管聯(lián)合干細(xì)胞組脊髓損傷近遠(yuǎn)端的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；套管聯(lián)合干細(xì)胞組脊髓損傷近遠(yuǎn)端的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)；C，D對(duì)照組脊髓損對(duì)照組脊髓損傷近遠(yuǎn)端星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，均為傷近遠(yuǎn)端星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，均為400 xABCD套管聯(lián)合干細(xì)胞組套管聯(lián)合干細(xì)胞組 對(duì)照組對(duì)照

10、組 套管聯(lián)合干細(xì)胞組套管聯(lián)合干細(xì)胞組 對(duì)照組對(duì)照組 近端近端遠(yuǎn)端遠(yuǎn)端1.3 1.3 脊髓內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)脊髓內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)-軸突軸突 ABCDE髓鞘在不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)（髓鞘在不同時(shí)間點(diǎn)形態(tài)（10000 x）A：正常軸突；：正常軸突； B： 2W時(shí)套管干細(xì)胞組軸突；時(shí)套管干細(xì)胞組軸突；C： 2W時(shí)對(duì)照組軸突時(shí)對(duì)照組軸突; D: 14W時(shí)套管干細(xì)胞組軸突時(shí)套管干細(xì)胞組軸突; E: 14W時(shí)對(duì)照組軸突時(shí)對(duì)照組軸突2 2 檢測(cè)神經(jīng)纖維穿越損傷位點(diǎn)檢測(cè)神經(jīng)纖維穿越損傷位點(diǎn) ABC神經(jīng)逆行示蹤陽(yáng)性細(xì)胞及神經(jīng)纖維神經(jīng)逆行示蹤陽(yáng)性細(xì)胞及神經(jīng)纖維A A：正常大鼠大腦，：正常大鼠大腦，400 x; B400 x; B：1

11、4w14w時(shí)套管干細(xì)胞組大腦，時(shí)套管干細(xì)胞組大腦，400 x; C: 14w 400 x; C: 14w 時(shí)時(shí)套管干細(xì)胞組脊髓神經(jīng)纖維，套管干細(xì)胞組脊髓神經(jīng)纖維，100 x100 x 2.1 逆行示蹤結(jié)果逆行示蹤結(jié)果陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) * 2.2 2.2 功能學(xué)評(píng)價(jià)功能學(xué)評(píng)價(jià)-BBB-BBB評(píng)分評(píng)分0 02 24 46 68 810101212141416161 12 24 46 68 8101012121414Time (Weeks)Time (Weeks)BBB ScoreBBB ScoreT T組組T+MT+M組組CONCON組組粉線代表粉線代表MSCs移植組；藍(lán)線代表套管組，黑線

12、代表對(duì)照組移植組；藍(lán)線代表套管組，黑線代表對(duì)照組-知覺(jué)功能評(píng)分知覺(jué)功能評(píng)分00.511.522.533.51 12 24 46 68 8101012121414Time (Weeks)Time (Weeks)Sensory ScoreSensory ScoreT T組組T+MT+M組組CONCON組組粉線代表粉線代表MSCs移植組；藍(lán)線代表套管組，黑線代表對(duì)照組；移植組；藍(lán)線代表套管組，黑線代表對(duì)照組；0代表沒(méi)有任何代表沒(méi)有任何知覺(jué)，知覺(jué)，4代表知覺(jué)完全正常代表知覺(jué)完全正常3 3 檢測(cè)檢測(cè)MSCsMSCs在套管內(nèi)的生長(zhǎng)情況在套管內(nèi)的生長(zhǎng)情況 abca-c, MSCs移植1天后的分布,脊髓遠(yuǎn)端；

13、d-f, MSCs移植4W后的分布，脊髓遠(yuǎn)端；g-i，MSCs移植8W后的分布，脊髓近端；a, d, g為熒光照射；b, e, h為透射光照射；c, f, i為前兩圖疊加效果一天 遠(yuǎn)端 3.1 MSCs 在脊髓中遷移和分布在脊髓中遷移和分布 defghi四周 遠(yuǎn)端八周 近端3.2 MSCs3.2 MSCs在脊髓中增殖在脊髓中增殖 abcdefu 八八 周周u 五天五天MSCs在大鼠脊髓中生長(zhǎng)狀態(tài)在大鼠脊髓中生長(zhǎng)狀態(tài) a-c, MSCs移植移植5天時(shí)的狀態(tài)；天時(shí)的狀態(tài)；d-f, MSCs移植移植8W時(shí)的狀態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且大時(shí)的狀態(tài)，可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，且大量的增殖量的增殖. a,

14、d為熒光照射；為熒光照射；b, e為透射光照射；為透射光照射；c,f為前兩圖疊加為前兩圖疊加 三、小結(jié)與討論三、小結(jié)與討論小小 結(jié)結(jié) 從組織學(xué)、功能學(xué)角度評(píng)價(jià)脊髓半橫斷損傷后再生狀況 （1 1）長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)用到的甲殼質(zhì)套管在脊髓中有）長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)用到的甲殼質(zhì)套管在脊髓中有固形作用固形作用 （2 2）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合MSCsMSCs，脊髓空洞、膠質(zhì)瘢痕均相對(duì)減少，髓鞘再脊髓空洞、膠質(zhì)瘢痕均相對(duì)減少，髓鞘再生狀態(tài)良好生狀態(tài)良好；但套管組和套管聯(lián)合干細(xì)胞組之間比較差異不明顯；但套管組和套管聯(lián)合干細(xì)胞組之間比較差異不明顯 （3 3）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合）應(yīng)用甲殼質(zhì)

15、套管或復(fù)合MSCsMSCs，發(fā)現(xiàn)大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠運(yùn)動(dòng)功能和知覺(jué)功能均得到明顯運(yùn)動(dòng)功能和知覺(jué)功能均得到明顯的改善的改善，功能恢復(fù)均顯著優(yōu)于單純脊髓半切，逆行示蹤結(jié)果也表明神經(jīng)再生，功能恢復(fù)均顯著優(yōu)于單純脊髓半切，逆行示蹤結(jié)果也表明神經(jīng)再生過(guò)程中，過(guò)程中，部分神經(jīng)纖維跨過(guò)損傷位點(diǎn)生長(zhǎng)部分神經(jīng)纖維跨過(guò)損傷位點(diǎn)生長(zhǎng)；但套管組和套管聯(lián)合干細(xì)胞組之；但套管組和套管聯(lián)合干細(xì)胞組之間比較差異不明顯。間比較差異不明顯。 MSCs移植脊髓損傷位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)：（1 1）MSCsMSCs在脊髓中能夠從損傷位點(diǎn)遠(yuǎn)端向近端遷移，從脊髓邊緣向中央遷移在脊髓中能夠從損傷位點(diǎn)遠(yuǎn)端向近端遷移，從脊髓邊緣向中央遷移（2 2）8 8周時(shí)干細(xì)胞大量增殖周時(shí)干細(xì)胞大量增殖討討 論論 本實(shí)驗(yàn)首次將改造后的甲殼質(zhì)套管用于修復(fù)大鼠脊髓半切損傷本實(shí)驗(yàn)首次