甲殼質(zhì)套管聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對脊髓損傷修復(fù)的作用

1、甲殼質(zhì)套管聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞對脊髓損傷修復(fù)的作用 阿麗婭，宋有鑫，姜保國阿麗婭，宋有鑫，姜保國 北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科北京大學(xué)人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科 基金支持：國家基金支持：國家973重大基礎(chǔ)研究項目重大基礎(chǔ)研究項目(2003CB515306)背景介紹背景介紹中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷危害中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷危害傳統(tǒng)脊髓損傷的治療策略傳統(tǒng)脊髓損傷的治療策略組織工程再生醫(yī)學(xué)概念組織工程再生醫(yī)學(xué)概念支架材料支架材料 + 種子細胞（生長因子種子細胞（生長因子）支架材料的研究趨勢支架材料的研究趨勢 天然支架材料天然支架材料 人工合成不可降解支架材料人工合成不可降解支架材料 人工合成生物可降解支架材料人工合成生物可降解

2、支架材料甲殼質(zhì)套管甲殼質(zhì)套管 中空圓柱形套管中空圓柱形套管( (北京大學(xué)人民醫(yī)院與中國紡織科學(xué)院共同發(fā)明，專北京大學(xué)人民醫(yī)院與中國紡織科學(xué)院共同發(fā)明，專利號利號:01136314.2),:01136314.2),套管尺寸套管尺寸: :壁厚壁厚0.1mm,0.1mm,內(nèi)徑內(nèi)徑 1.5mm1.5mm。 是一種天然高分子聚合物是一種天然高分子聚合物, ,學(xué)名為學(xué)名為(1 ,4)-2-(1 ,4)-2-乙酰氨基乙酰氨基-2-2-脫氧脫氧-D-D-葡萄糖葡萄糖 。甲殼質(zhì)來源于天然海洋生物生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì)。甲殼質(zhì)來源于天然海洋生物生物體結(jié)構(gòu)物質(zhì), ,可被體內(nèi)的酶分可被體內(nèi)的酶分解而吸收解而吸收, ,具有良好

3、的吸濕性、紡絲性和成膜性。具有良好的吸濕性、紡絲性和成膜性。生物學(xué)特性生物學(xué)特性 對生物體無毒性和炎癥反應(yīng)對生物體無毒性和炎癥反應(yīng) 易于在體內(nèi)降解吸收易于在體內(nèi)降解吸收 降解吸收周期適宜，可人為調(diào)控降解吸收周期適宜，可人為調(diào)控 前期實驗已證實前期實驗已證實 “甲殼質(zhì)套管能夠促進損傷甲殼質(zhì)套管能夠促進損傷 后的周圍神經(jīng)再生后的周圍神經(jīng)再生 ” 種子細胞種子細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞 神經(jīng)干細胞神經(jīng)干細胞 雪旺氏細胞雪旺氏細胞 嗅鞘細胞嗅鞘細胞 目的：初步探討對脊髓損傷修復(fù)是否有影響目的：初步探討對脊髓損傷修復(fù)是否有影響 甲殼質(zhì)套管甲殼質(zhì)套管 + 骨髓間充質(zhì)干細胞骨髓間充質(zhì)干細胞 一一

4、、 材料和方法材料和方法-材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備甲殼質(zhì)套管：無菌甲殼質(zhì)套管：無菌 3-4mm骨髓間充質(zhì)干細胞（骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell, MSCs)體外培養(yǎng)體外培養(yǎng) 品系：雄性小鼠品系：雄性小鼠C57BL，表達綠色熒光蛋白，表達綠色熒光蛋白 體重：體重：20g20g2 2 取材：股骨取材：股骨、脛骨、髂骨、脛骨、髂骨 換液培養(yǎng)，取傳代后第換液培養(yǎng)，取傳代后第3 3代細胞移植（代細胞移植（異種移植異種移植） defabc第三代第三代三種形態(tài)三種形態(tài)a-c MSCs傳代后的第傳代后的第3代；代；d-f MSCs的三種形態(tài)；的三種形態(tài)； a,d MSCs自發(fā)熒光；自發(fā)熒

5、光；b,e 透透射光照射圖像；射光照射圖像；c,f 前兩圖的疊加效果前兩圖的疊加效果. 藍紅黃箭頭：多角形，扁平不規(guī)則形，藍紅黃箭頭：多角形，扁平不規(guī)則形，紡錘形紡錘形實驗動物實驗動物 70只雄性只雄性SD大鼠，體重約大鼠，體重約30025g 動物模型為脊髓右側(cè)半橫斷傷，隨機分動物模型為脊髓右側(cè)半橫斷傷，隨機分4組組,每組每組20只（除正常只（除正常組）組）u正常組正常組：10只只對照組：單純半切損傷模型，不予任何治療；對照組：單純半切損傷模型，不予任何治療；甲殼質(zhì)套管治療組：半切損傷后套管植入治療；甲殼質(zhì)套管治療組：半切損傷后套管植入治療；甲殼質(zhì)套管聯(lián)合甲殼質(zhì)套管聯(lián)合 MSCs組組: 半切損

6、傷后套管植入半切損傷后套管植入,移植細胞；移植細胞； 取材時間點取材時間點: 2w,4w,8w,14w,長期組（長期組（ 組）組） 1d,5d,7d,4w,8w（組）組）脊髓半切損傷動物模型制作流程脊髓半切損傷動物模型制作流程-方法和評估指標(biāo)方法和評估指標(biāo)1 1 套管內(nèi)套管內(nèi)脊髓損傷位點脊髓損傷位點組織學(xué)觀察組織學(xué)觀察1.1 脊髓空洞脊髓空洞（免疫組化（免疫組化-HE染色）染色） 8w時組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，時組織固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，HE染色染色1.2 膠質(zhì)瘢痕膠質(zhì)瘢痕（免疫熒光（免疫熒光-檢測星形膠質(zhì)細胞，檢測星形膠質(zhì)細胞，GFAP染色）染色） 2w/8w組織固定組織固

7、定-再后固定，包埋，冰凍切片，丙酮固再后固定，包埋，冰凍切片，丙酮固 定后洗片封閉，分別加入抗大鼠定后洗片封閉，分別加入抗大鼠GFAP蛋白一抗和相應(yīng)二抗蛋白一抗和相應(yīng)二抗 1.3 軸突軸突（透射電鏡（透射電鏡- 2W和和14W時檢測超微結(jié)構(gòu)）時檢測超微結(jié)構(gòu)） 戊二醛固定，后固定，脫水包埋，切片，復(fù)染后觀察戊二醛固定，后固定，脫水包埋，切片，復(fù)染后觀察 2. 2. 檢測檢測神經(jīng)纖維是否穿越損傷位點神經(jīng)纖維是否穿越損傷位點2.1 神經(jīng)逆行性示蹤：神經(jīng)逆行性示蹤：對照組、套管組分別在2周、14周于損傷位點遠端注 射10%BDA, 多點注射，10天后取大腦和脊髓，脊髓分為近段、遠段和損傷段，染色顯影，

8、陽性細胞計數(shù)2.2 功能學(xué)評價功能學(xué)評價：BBB功能評分；知覺功能評分，分別在術(shù)后1w，2w，4w，6w， 8w，10w，12w, 14w檢測3. 3. 檢測檢測MSCsMSCs在套管內(nèi)的生長情況在套管內(nèi)的生長情況： 激光共聚焦顯微鏡激光共聚焦顯微鏡觀察是否增殖、遷移，分別在1d，5d，7d，4w，8w檢測二、實驗結(jié)果二、實驗結(jié)果1 1 脊髓損傷位點組織學(xué)觀察脊髓損傷位點組織學(xué)觀察 AB套管組術(shù)中和術(shù)后大體形態(tài)觀察套管組術(shù)中和術(shù)后大體形態(tài)觀察A:建立脊髓半橫斷模型后套管縫合建立脊髓半橫斷模型后套管縫合(4x)；B：6個月后損傷脊髓套管縫合的外觀（個月后損傷脊髓套管縫合的外觀（4x） 1.1 1

9、.1 脊髓空洞（脊髓空洞（8W8W） CAB脊髓損傷位點免疫組化染色脊髓損傷位點免疫組化染色A：套管組：套管組(100 x)， B：MSCs移植組移植組(100 x)；C：對照組（：對照組（100 x），均為），均為8W 1.2 1.2 膠質(zhì)瘢痕（膠質(zhì)瘢痕（2W2W） 脊髓半橫斷后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的變化脊髓半橫斷后星形膠質(zhì)細胞形態(tài)的變化A，B套管聯(lián)合干細胞組脊髓損傷近遠端的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)；套管聯(lián)合干細胞組脊髓損傷近遠端的星形膠質(zhì)細胞形態(tài)；C，D對照組脊髓損對照組脊髓損傷近遠端星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)，均為傷近遠端星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)，均為400 xABCD套管聯(lián)合干細胞組套管聯(lián)合干細胞組 對照組對照

10、組 套管聯(lián)合干細胞組套管聯(lián)合干細胞組 對照組對照組 近端近端遠端遠端1.3 1.3 脊髓內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)脊髓內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)-軸突軸突 ABCDE髓鞘在不同時間點形態(tài)（髓鞘在不同時間點形態(tài)（10000 x）A：正常軸突；：正常軸突； B： 2W時套管干細胞組軸突；時套管干細胞組軸突；C： 2W時對照組軸突時對照組軸突; D: 14W時套管干細胞組軸突時套管干細胞組軸突; E: 14W時對照組軸突時對照組軸突2 2 檢測神經(jīng)纖維穿越損傷位點檢測神經(jīng)纖維穿越損傷位點 ABC神經(jīng)逆行示蹤陽性細胞及神經(jīng)纖維神經(jīng)逆行示蹤陽性細胞及神經(jīng)纖維A A：正常大鼠大腦，：正常大鼠大腦，400 x; B400 x; B：1

11、4w14w時套管干細胞組大腦，時套管干細胞組大腦，400 x; C: 14w 400 x; C: 14w 時時套管干細胞組脊髓神經(jīng)纖維，套管干細胞組脊髓神經(jīng)纖維，100 x100 x 2.1 逆行示蹤結(jié)果逆行示蹤結(jié)果陽性細胞計數(shù)陽性細胞計數(shù) * 2.2 2.2 功能學(xué)評價功能學(xué)評價-BBB-BBB評分評分0 02 24 46 68 810101212141416161 12 24 46 68 8101012121414Time (Weeks)Time (Weeks)BBB ScoreBBB ScoreT T組組T+MT+M組組CONCON組組粉線代表粉線代表MSCs移植組；藍線代表套管組，黑線

12、代表對照組移植組；藍線代表套管組，黑線代表對照組-知覺功能評分知覺功能評分00.511.522.533.51 12 24 46 68 8101012121414Time (Weeks)Time (Weeks)Sensory ScoreSensory ScoreT T組組T+MT+M組組CONCON組組粉線代表粉線代表MSCs移植組；藍線代表套管組，黑線代表對照組；移植組；藍線代表套管組，黑線代表對照組；0代表沒有任何代表沒有任何知覺，知覺，4代表知覺完全正常代表知覺完全正常3 3 檢測檢測MSCsMSCs在套管內(nèi)的生長情況在套管內(nèi)的生長情況 abca-c, MSCs移植1天后的分布,脊髓遠端；

13、d-f, MSCs移植4W后的分布，脊髓遠端；g-i，MSCs移植8W后的分布，脊髓近端；a, d, g為熒光照射；b, e, h為透射光照射；c, f, i為前兩圖疊加效果一天 遠端 3.1 MSCs 在脊髓中遷移和分布在脊髓中遷移和分布 defghi四周 遠端八周 近端3.2 MSCs3.2 MSCs在脊髓中增殖在脊髓中增殖 abcdefu 八八 周周u 五天五天MSCs在大鼠脊髓中生長狀態(tài)在大鼠脊髓中生長狀態(tài) a-c, MSCs移植移植5天時的狀態(tài)；天時的狀態(tài)；d-f, MSCs移植移植8W時的狀態(tài)，可見細胞生長狀態(tài)良好，且大時的狀態(tài)，可見細胞生長狀態(tài)良好，且大量的增殖量的增殖. a,

14、d為熒光照射；為熒光照射；b, e為透射光照射；為透射光照射；c,f為前兩圖疊加為前兩圖疊加 三、小結(jié)與討論三、小結(jié)與討論小小 結(jié)結(jié) 從組織學(xué)、功能學(xué)角度評價脊髓半橫斷損傷后再生狀況 （1 1）長期觀察發(fā)現(xiàn)本實驗用到的甲殼質(zhì)套管在脊髓中有）長期觀察發(fā)現(xiàn)本實驗用到的甲殼質(zhì)套管在脊髓中有固形作用固形作用 （2 2）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合MSCsMSCs，脊髓空洞、膠質(zhì)瘢痕均相對減少，髓鞘再脊髓空洞、膠質(zhì)瘢痕均相對減少，髓鞘再生狀態(tài)良好生狀態(tài)良好；但套管組和套管聯(lián)合干細胞組之間比較差異不明顯；但套管組和套管聯(lián)合干細胞組之間比較差異不明顯 （3 3）應(yīng)用甲殼質(zhì)套管或復(fù)合）應(yīng)用甲殼質(zhì)

15、套管或復(fù)合MSCsMSCs，發(fā)現(xiàn)大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠運動功能和知覺功能均得到明顯運動功能和知覺功能均得到明顯的改善的改善，功能恢復(fù)均顯著優(yōu)于單純脊髓半切，逆行示蹤結(jié)果也表明神經(jīng)再生，功能恢復(fù)均顯著優(yōu)于單純脊髓半切，逆行示蹤結(jié)果也表明神經(jīng)再生過程中，過程中，部分神經(jīng)纖維跨過損傷位點生長部分神經(jīng)纖維跨過損傷位點生長；但套管組和套管聯(lián)合干細胞組之；但套管組和套管聯(lián)合干細胞組之間比較差異不明顯。間比較差異不明顯。 MSCs移植脊髓損傷位點后，發(fā)現(xiàn)：（1 1）MSCsMSCs在脊髓中能夠從損傷位點遠端向近端遷移，從脊髓邊緣向中央遷移在脊髓中能夠從損傷位點遠端向近端遷移，從脊髓邊緣向中央遷移（2 2）8 8周時干細胞大量增殖周時干細胞大量增殖討討 論論 本實驗首次將改造后的甲殼質(zhì)套管用于修復(fù)大鼠脊髓半切損傷本實驗首次