ABCELISA定量測定紅細胞趨化因子受體及意義

1、ABCELISA定量測定紅細胞趨化因子受體及意義              作者：張樂之，盧曉丹，龔燕芳，郭 峰 【摘要】  目的  建立ABC-ELISA定量測定紅細胞趨化因子受體(ECKR)的方法并探討其臨床意義。方法  分離一定數(shù)量紅細胞與IL-8結合，離心后取上清液用ABC-ELISA法檢測IL-8含量，通過公式計算紅細胞趨化因子受體結合活性；對該法檢測IL-8的靈敏度、精密度、準確度進行了探討，并對31例正常人，25例惡性腫瘤

2、患者和33例銀屑病患者的ECKR進行了測定。結果  該法檢測IL-8的靈敏度為15.6pg/ml。精密度批內(nèi)平均CV 4.69%；批間平均CV 9.79%，準確度平均回收率為97%。31例正常人ECKR為(52.96±10.45)%；25例惡性腫瘤ECKR為(46.07±13.33)%；33例銀屑病人ECKR為(46.87±10.28)%。經(jīng)統(tǒng)計，惡性腫瘤患者和銀屑病患者ECKR均比正常人ECKR要低(P<0.05)。結論  該法是一種簡便的定量測定ECKR的新方法，對研究紅細胞免疫、趨化因子及其受體在疾病防治和發(fā)病機理中的作用有一定價值

3、。        【關鍵詞】  紅細胞趨化因子受體；鏈霉親和素生物素-ELISA；白介素-8；紅細胞免疫                【Abstract】  Objective  To develop a quantitative ABC-ELISA and to investigate the clinical significance for huma

4、n erythrocyte chemokine receptor.Methods  Isolated erythrocytes bound to IL-8. After centrifuge IL-8 levels were measured with ABC-ELISA in the supernatant. Activity of erythrocyte chemokine receptor were calculated by formula.Results  The minimum detectable limit was 15.6pg/ml. Precision：

5、 The mean coefficients of variation were 4.69% for inter-assay and 9.79% for intra-assay， respectively. Accuracy： The mean recovery rate was 97%. In 31 normal adults， the ECKR binding activity (±s%) was 52.96±10.45. In 25 tumors， 33 psoriasises， it was 46.07±13.33， 46.87±10.28 re

6、spectively. The ECKR binding activity of the tumors and the psoriasises decreased significantly (P<0.05) compares with normal control group by statistics.Conclusion  A quantitative ABC-ELISA for erythrocyte chemokine receptor is a simple and new method. The detection of the ECKR binding acti

7、vity has a value to study RBC immune， chemokine and its receptor in preventing， treating and the pathogenesis of the disease.        【Key words】  erythrocyte chemokine receptor；ABC-ELISA；interleukin-8；erythrocyte immune        1982年郭峰1

8、在國內(nèi)首先建立了測定紅細胞免疫粘附功能的方法，并證明紅細胞的免疫粘附功能主要是通過CR1實現(xiàn)的。該法簡便易行，沿用至今。二十年來，紅細胞免疫研究逐漸深入，已發(fā)現(xiàn)紅細胞表達多種天然免疫受體和物質(zhì)，如CR1、CR3、CD44、CD58、CD59、DAF、SOD酶和趨化因子受體(CKR)等，其中每個紅細胞上的紅細胞趨化因子受體(ECKR)表達的數(shù)量比CR1要多2，但對ECKR的作用卻知之甚少。因此我們建立了ABC-ELISA定量測定ECKR方法并初步應用于臨床，現(xiàn)報告如下。        1  材料與方法  &

9、#160;     1.1  材料        1.1.1  主要實驗試劑和儀器  人重組白介素-8(IL-8)純品(北京醫(yī)科大學分子免疫室產(chǎn)品)；人鏈霉親和素生物素-ELISA(ABC-ELISA)試劑盒(法國Diaclone公司產(chǎn)品)；微晶纖維素(上海趙屯藥廠產(chǎn)品)；-纖維素(浙江湖州食品化工聯(lián)合公司產(chǎn)品)；淋巴細胞分離液(上海試劑二廠產(chǎn)品)；酶標儀(芬蘭Labsystems公司制造)。        1.1.

10、2  實驗對象  采自本院體檢健康者和門診或住院患者。正常對照組31例，男21例，女10例，平均年齡33歲；銀屑病患者33例，男22例，女11例，平均年齡43歲；惡性腫瘤患者25例，男13例，女12例，平均年齡50歲。        1.2  方法        1.2.1  紅細胞分離柱制備  取玻璃滴管，裝入少許脫脂棉花，再加入用生理鹽水配成的-纖維素/微晶纖維素(1：1，W/W)，柱高約1cm，最后加入生理鹽水，如生理鹽

11、水能濾過，分離柱即可使用。        1.2.2  紅細胞懸液制備  取枸櫞酸鈉抗凝新鮮血1ml，淋巴細胞分離液分離后取沉底紅細胞，用生理鹽水約作稀釋后加入紅細胞分離柱，最后再用生理鹽水將紅細胞洗滌下來，收集的紅細胞懸液用涂片鏡檢法或白細胞計數(shù)法證實不含白細胞，將此懸液用生理鹽水配成含紅細胞數(shù)量為3.0×1012/L。        1.2.3  人重組IL-8應用液制備  取人IL-8 ABC-ELISA試劑盒中標準品稀

12、釋液1ml溶解人重組IL-8(10g/ml)，再作1：20稀釋即為應用液，分裝保存-20備用。        1.2.4  ECKR與IL-8結合反應  在待測樣本管中分別加紅細胞懸液100l，pH7.4 PBS緩沖液(含1%BSA)100l，人重組IL-8應用液100l；在陽性對照管中分別加pH7.4 PBS緩沖液(含1%BSA)200l，人重組IL-8應用液100l。將以上試管輕輕混勻并蓋上紗布，放37水箱孵育15min(中途輕輕搖勻一次)，取出離心(2000r/min)5min，吸上清100l，即刻檢測IL-

13、8含量或置-20待測。        1.2.5  靈敏度試驗  取ABC-ELISA試劑盒中的IL-8標準品用標準品稀釋液作倍比稀釋后測定IL-8含量。        1.2.6  精密度試驗  取人胃粘膜活檢物培養(yǎng)上清液，測其IL-8含量，留取高、中、低濃度IL-8上清液共6份，其中3份作批內(nèi)重復試驗各測10孔；另3份作批間重復試驗每周測1次，共各測10次。       

14、1.2.7  準確度試驗  取ABC-ELISA試劑盒中高、中、低濃度IL-8標準品作回收試驗，計算平均回收率。        1.2.8  ECKR結合活性測定  從冰箱取出IL-8 ABC-ELISA試劑盒平衡至室溫，操作步驟為：分別取以上樣本管和陽性對照管上清100l加入對應酶標板孔中，每孔再加50l已稀釋的生物素化抗體，將酶標板放室溫反應1h后洗板3次，在每孔中再加入100l HRP標記的鏈霉親和素，室溫反應30min后洗板3次，每孔加100l TMB顯色液，避光顯色1215min后每孔

15、加100l終止液，立即在450nm波長的酶標儀上比色測定OD值。ECKR結合活性=(陽性對照管OD值-樣本管OD值)/陽性對照管OD值×100%。        2  結果        2.1  靈敏度  該法測定IL-8的最低濃度可達15.6pg/ml。        2.2  精密度  批內(nèi)重復試驗結果：對高濃度(IL-8含量為1658pg/

16、ml)上清液測定的CV值為2.12%，中濃度(IL-8含量為758pg/ml)上清液測定的CV值為4.71%，低濃度(IL-8含量為135pg/ml)上清液測定的CV值為7.23%，平均CV值為4.69%。批間重復試驗：3份培養(yǎng)上清液的IL-8含量為1763pg/ml、827pg/ml、168pg/ml，其對應CV值分別為13.64%、9.51%、6.21%，平均CV值為9.79%。        2.3  準確度  回收試驗結果：IL-8標準品濃度分別為1000pg/ml、500pg/ml、62.5pg/ml，其

17、對應回收率分別為89%、95%、107%，平均回收率為97%。        2.4  測定結果  正常對照組、銀屑病患者及惡性腫瘤患者ECKR結合活性測定結果見表1。 表1  各組ECKR結合活性檢測結果  (%，x±s)    注：與正常人組比較*P<0.05     3  討論        在傳統(tǒng)的酶免疫測定技術中，反應物與固相的結合

18、常常是有限和不夠充分的。尤其是實驗過程中經(jīng)歷多次沖洗步驟、長時間溫育、溫度高及采用了含表面活性劑的緩沖液時，會出現(xiàn)解吸附。由于解吸附作用，使得這類免疫測定法的靈敏度、精密度和準確度均受到影響。        ABC-ELISA是通過鏈霉親和素-生物素捕獲系統(tǒng)將抗體、抗原或免疫復合物間接地固定于固相之上的測定方法。該法中鏈霉親和素是一種大分子量(60000道爾頓)寡聚蛋白，等電點為7.0，每個分子含有四個相同的亞基，每個亞基均有一個生物素結合位點。鏈霉親和素復和物結合常數(shù)為1015L/mol，比經(jīng)典的抗原-抗體復合物的結合常數(shù)高100萬

19、倍以上，是目前所知最強的非共價相互作用。該法中的生物素也叫維生素H，為一小分子物質(zhì)(240道爾頓)，能與各種大分子結合，結合后它的其它生物學活性或與其它分子的特異相互作用不發(fā)生改變。它與鏈霉親和素的專一結合能力甚至在不利的反應條件下也不會受到影響。由于這兩種分子間的高親和力，使得它們形成的復合物在強烈的清洗條件下、pH變化或其它化學變化中都不會發(fā)生解離。因而，為利用該法檢測各種物質(zhì)提供了較好的質(zhì)量保證。本文方法測定IL-8的靈敏度可達15.6pg/ml，精密度為批內(nèi)平均CV值4.6%，批間平均CV值9.79%，準確度為平均回收率97%，是一種靈敏度高，測定結果較準確穩(wěn)定的簡便方法。 

20、       CKR與CK在體內(nèi)構成了一個復雜的網(wǎng)絡。其主要作用是作為特定細胞，如中性粒細胞、單核細胞、T淋巴細胞的趨化劑和活化劑，參與多種免疫和炎癥反應。在紅細胞上表達的CKR稱為ECKR，ECKR不僅存在于紅細胞、中性粒細胞和淋巴細胞，還表達在腦、腎、肺和胸腺。它是一種多配體的受體，既可結合IL-8、MGSA，又可結合MCP-1和RANIES，它還是間日瘧原蟲的受體，每個紅細胞上約有10009000個這種受體，并證實該受體就是血型D抗原46。本文結果表明惡性腫瘤患者和銀屑病人ECKR結合活性降低，提示紅細胞參與了這些疾病的發(fā)病過程，值得深入

21、研究。        目前對ECKR的生物學作用，與其它免疫細胞和細胞因子的相互關系，以及在各種疾病中的病理作用機理存在許多未知數(shù)。我們期待ABC-ELISA定量測定ECKR方法的建立可為基礎和臨床研究提供新手段，并為國內(nèi)紅細胞免疫研究開辟新的途徑。 【參考文獻】     1  郭峰，虞紫茜，趙書平.紅細胞免疫功能的初步研究.中華醫(yī)學雜志，1982，12：715.        2  Darbonue WC， Rice GC， Mohler MA， et al. Red blood cells are a sink for interleukin 8， A leukocyte chemotaxin. J Clin lnvest， 1991， 4：1362.        3  Horuk R， Chitnis CE， Darno